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烟曲霉菌感染的实验室检查方法

周艳 (综述 )

烟曲霉菌为空气中常见的腐生菌，为一种机会致病真菌，其孢子直径很小，

可被动吸入呼吸道，在一般的环境下，人们每天都能吸入上百个烟曲霉菌孢子，

但是通常情况下都不致病。近 20 年来随着广谱抗生素的滥用、肿瘤放疗和化疗，

造血干细胞移植术、实体器官移植术后应用免疫抑制剂及糖皮质激素等药物以及

肠外营养人数的增加以及艾滋病的流行等免疫抑制人群逐年增长[1]，临床上越来越

多的免疫力低下的人群感染烟曲霉菌导致侵袭性肺曲霉病（ invasive

pulmonary aspergillosis, IPA ）。侵袭性曲霉菌感染的发病率日益增长，其发病率已经超过了最常见的真菌感染—侵袭性念珠菌病。免疫力低下的老年病人发生侵袭性

曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。 IPA 以肺部感染为主，主要为急性坏死性

出血性肺炎，并可波及骨骼、脑、肝、肾、心脏等全身多个重要器官，其预后极差，死亡率高达 80％－ 90％[2]。由于 IPA 的发病机制尚未阐明，从而导

致IPA 的诊断极为困难，治疗成功率很低。为此，发展有效的烟曲霉菌感染实

验室检查方法对于该病的诊断与治愈显得尤为重要，目前常见的实验室检测方法

有：显微镜检查、病原生物学培养方法、血清免疫学检测法、分子生物学检测法

等。本文就这些方法的研究作一综述。

关键词：烟曲霉菌；聚合酶链反应；血清学诊断

1、显微镜检查

显微镜检查主要包括直接显微镜检查和组织病理学检查，都是以形态学特点为

基础来对病原微生物进行诊断。曲霉菌直接镜检呈现玻璃样透明的菌丝，但是其

菌丝结构特点的特异性并不突出，其他种类相似的真菌如青霉菌亦可呈现类似的镜

下特点。另一方面，组织病理学检查虽也是侵袭性曲霉菌感染确诊的“金标准”，病理表现为真菌菌丝侵入和定植于组织或者血管造成炎症改变。但是其报

告总中经常会出现曲霉样形态学特点等描述性的诊断结果，这对在镜下类似曲霉菌

类的其他病原微生物的鉴别诊断带来一定的困难，误诊的出现几乎不可避免。若是

发生误诊的两种病原微生物的治疗方案相差较大，就会严重影响治疗效果，从而进

一步导致预后不良。此外，检查者的主观因素也有可能对诊断结论产生影响。

2、病原微生物的培养

病原微生物的培养是诊断细菌与真菌感染的常规方法，特异性高，同时还可以用于细菌与真菌感染的药敏试验，为临床合理使用抗生素提供可靠的依据。标本病

原微生物的培养结果是侵袭性曲霉菌感染确诊的“金标准” ，这是曲霉菌感

染的诊断基础[3]。

烟曲霉菌培养是通过取病人血液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液（ BAL）、尿液及感染病理组织等标本，接种于真菌培养基培养，其中血液、 BAL及感染组织为常

用的取材标本。各实验室采用的培养基及培养温度时间各有不同，如蔡氏培养基适

用 26℃培养 3-4 天，沙保培养基适用 35℃培养 1-2 天，但因为培养时间长且敏感性

不高，因而可能延误病人的诊断和治疗。与白色念珠菌、新型隐球菌等单细胞真

菌比较，烟曲霉菌为丝状型真菌，组织的机械破碎对丝状真菌成活力及培养有很大

影响[4]。此外，由于曲霉菌是机会致病菌，从有菌区获取的阳性培养

结果并不能明确是由于定植的正常菌群或是侵袭性感染所致。

3、血清免疫学检测法

血清免疫学检测法是一种诊断病原因子感染的经典方法，原理是根据抗原抗体反应特异性的免疫学原理，检查患者血清、脑脊液、BAL、尿液等体液标

本中病原因子特异的抗原或抗体。在烟曲霉菌感染血清学检测法的研究报道

中，众多实验室研究的检测法都是围绕半乳甘露聚糖（GM）抗原而展开的。有

研究[5]结果提示：采用酶免疫测定法（EIA）检测 BAL标本中烟曲霉 GM抗原有

利于早期诊断并且指导治疗；阈值的设立对于 EIA 法的检测结果敏感性和特异性

会有影响。从 49 名确诊为侵袭性肺曲霉病（ IPA）的个体和 50 名疑为 IPA 的个

体采集的 BAL标本，进行 GM EIA的检测，当阈值设为 1.0 时，敏感性为61%；

检测阈值为 0.5 时，敏感性为 76%；相应的特异性分别为 98%和 94%。另外，从

22 名 BAL标本烟曲霉培养阴性病人获取标本做 GMEIA 测定，当检测阈

[6]

值为 1.0 时，敏感性为 41%；检测阈值为 0.5 时，敏感性为 59% 。还有实验室

采用实验诱导建立兔IPA 模型，然后用GM EIA 方法检测分析。当最佳阈值为

0.75 时，未处理对照组的敏感性和特异性都达到100%；而抗真菌治疗组敏感

[7]

性下降到 92% 。另外，该实验存在一定的假阳性，也无法区别定植还是感染。

还有实验室发展了一种基于检测抗-Afmp1p 抗原的抗体的酶联免疫吸附测定

（ELISA）法用于检测烟曲霉感染。这种 Afmp1p 抗原是一种纯化重组的烟曲霉细

胞壁抗原 GM蛋白。目前这种基于检测抗 -Afmp1p 抗原的抗体的 ELISA 法的敏

感性和特异性都比以前报导的基于检测其他抗原的ELISA 法高[8-9]。此外，有实

验室发展生物芯片技术检测GM效力用于评估前瞻性调查研究807 例病人的

3327 例血清，特异性为99.6%，但对证明是或可能是曲霉病病人人群，敏感性却

只有 50%，可能是本实验出现的少量的假阳性病例限制了实验的敏感性[10]。

其中引起假阳性的主要因素: (1)定植的曲霉释放的GM进入到血液循环系统；

(2)与其他许多真菌抗原出现交叉反应； (3) 使用环磷酰胺的潜在影响； (4)

交叉感染； (4) cut-off值的影响等等。

血清免疫学检测实验方法及检测目标的多样化，加快了烟曲霉感染诊断的步伐，检测阈值也急需各实验室之间规范化。除了上述几个实验室涉及的血清学

[11]

诊断检测目标及检测实验方法，还有其他的检测目标如： galf 抗原、 BG 等等。4、

分子生物学诊断

聚合酶链反应（ PCR）分子生物学技术是一种新型的烟曲霉感染诊断方法，诊断的灵敏性高，越来越被人们所关注。目前成了国内外研究的热点，其技术的

关键部分有聚合酶链反应( PCR) 扩增、 DNA 分子探针、限制性酶切片段长度多

态性分析 ( RFLP) 、随机扩增 DNA 多态性 (RAPD) 等方法，其中 PCR法具有特异性强、重复性好、全封闭反应、灵敏、快速等优点，因此，欧洲和美国FDA 推荐其

用来诊断 IPA，也被称为目前最理想的分子生物学方法。PCR诊断的检测标本有血

清、脑脊液、 BAL、尿液等，检测靶基因各实验室各有不同，检测方法也在不断

改进，由开始的普通 PCR、半定量 PCR、定量 PCR到实时 PCR到定量实时 PCR、巢式PCR等等[12]。PCR检测体系的靶基因主要包括烟曲霉菌一些基因位点的保守序列或

是线粒体 DNA 片段。首先将标本中可能存在的烟曲霉菌 DNA 提取出来，利用实时

荧光定量 PCR 将其扩增得出初始标本中的曲霉菌 DNA 拷贝数或是利用传统

PCR将其扩增后，利用其他分析方法对扩增后产物进行分析，从而得到初始标本

中的曲霉菌的量和种类等相关信息。PCR诊断技术类似于烟曲霉 DNA的天然复制过

程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。有实验研究表明：从49名已证明为侵袭性肺曲霉病（IPA）病人和 50名可能为 IPA病人获取 BAL标本，靶

基因为烟曲霉真菌 219 bp 片段长度 18s rRNA基因，采用定量 PCR检测方法检测的