烟曲霉不同菌株致病力差异的研究

作者：张宇宋文刚高嵩刘攀王丽

【摘要】目的通过筛选出致病力最强和最弱的菌株研究烟曲霉的致病机制。方法 spf级雄性icr小鼠216只，体重(20±0.5)g。随机分9组，每组8只（感染组7组，阴性对照组和正常对照组各1组）。其中感染组和阴性对照组小鼠免疫抑制后，分别接种7株烟曲霉的孢子悬液和生理盐水。正常对照组不注射环磷酰胺和孢子悬液。每日观察小鼠的生存状态。对死亡小鼠和处死小鼠的脏器进行组织匀浆菌落计数和病理学检测。实验重复3次。通过比较生存率、中位生存期、平均体重、组织匀浆菌落计数和组织病理学变化等来比较烟曲霉的致病力差异。结果①感染组小鼠接种孢子悬液后，体重迅速下降。肺组织病理学检测观察到组织坏死，菌丝聚集；肺组织匀浆培养得到的菌株经分子生物学鉴定为烟曲霉。②阴性对照组小鼠体重下降速度较感染组慢，无死亡；肺组织病理学检测未见菌丝侵袭。③通过比较生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标，从7株烟曲霉中筛选得到致病力最强和最弱的菌株（烟曲霉jlc 50134和jlc 30566）。结论不同烟曲霉菌株间存在致病力的差异。

【关键词】致病力；动物模型；烟曲霉

烟曲霉（aspergillus fumigatus）感染所致侵袭性肺曲霉病（ipa）是引起高危患者（如中性粒细胞减少症、造血干细胞移植、长期高剂量使用激素和血液恶性肿瘤等免疫力低下患者）致死性感染的主要原因。由于ipa的发病率高、病情进展迅速、死亡率高（60%～90%）及缺乏有效的治疗药物〔1～2〕，其相关研究受到了极大关注。目前，烟曲霉的致病机制尚不明确，已往的研究多集中在通过改造单一或几个与致病性相关的基因来研究菌株的致病机制〔3〕，而通过比较不同烟曲霉菌株间致病力差异进行研究在国内尚未见报道。获得致病力不同的菌株，可以全面、系统地分析和比较与致病力相关的诸多因素，对烟曲霉的致病机制以及治疗药物开发等方面的研究非常必要。本研究将通过评价生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标，比较7株不同烟曲霉致病力的差异。 1 材料与方法

1.1 材料

spf级icr小鼠216只，雄性，6周龄，体重(20±0.5)g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，许可证号：scxk吉2007 2003。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》〔4〕。烟曲霉共7株，其中，强毒株jlc 50134由日本国立千叶大学真菌医学研究中心馈赠，编号ifm 40808。jlc 30542、jlc 30890、jlc 30859、jlc 30566、jlc 31106及jlc 31753分离自临床患者和环境样本，经分子生物学鉴定后，由吉林大学真菌研究中心菌种保藏中心(culture collection of jilin university mycology research center)分离并保藏。实验用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）购自difco公司，注射用环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬液的制备

将烟曲霉接种于pda斜面培养基上，28℃培养5 d。用含有0.05%吐温 80的生理盐水制备一定浓度的孢子悬液。将孢子悬液进行连续稀释后涂布在pda平板培养基上，28℃培养3 d，进行菌落计数，与涂布的孢子悬液浓度进行比较，计算孢子活力〔（菌落计数×稀释倍数）/孢子悬液浓度〕＞90%可进行接种〔5〕。

1.2.2 接种浓度的确定

配制烟曲霉jlc 50134的孢子悬液（浓度：1.0×103～1.0×109 cfu/ml共7个梯度）感染小鼠，每个浓度10只，预计选用3 d内导致50%小鼠死亡的孢子悬液浓度作为实验接种浓度〔5〕。

1.2.3 动物的免疫抑制和分组

随机挑选小鼠216只，分9组（感染组7组，阴性对照组和正常对照组各1组），每组8只。饲养于ivc鼠笼中，室温（24℃～26℃），保持湿度，日照14 h和黑夜10 h交替进行，

垫料、食物和水灭菌处理。饮水中加入四环素（1 mg/ml）防止细菌感染，实验过程中不限食水。感染组和阴性对照组第1、4天腹腔注射环磷酰胺（150 mg/kg）进行免疫抑制〔5〕，第5天尾静脉采血计数外周血白细胞数量，通过白细胞减少的程度确定小鼠是否受到免疫抑制。

1.2.4 实验动物的接种

小鼠通过吸入乙醚麻醉，使其昏迷超过1 min，抑制吞咽反射。取30 μl不同浓度或不同菌株的烟曲霉孢子悬液（孢子活力＞90%）滴入一侧鼻孔；阴性对照组小鼠进行同样麻醉，接种等量的含有0.05%吐温80的生理盐水；正常对照组小鼠不注射孢子悬液和生理盐水。

1.2.5 动物感染过程监测、脏器处理及感染菌株鉴定

感染后15 d内，每日观察小鼠的生存状态，测量体重，计算生存率；取感染死亡小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏进行组织匀浆，稀释至浓度为1.0×10-3g/ml。取200 μl涂布在pda平板培养基上，28℃培养3 d，进行菌落计数。将脏器剩余部分用10%（v/v）甲醛固定，浸入石蜡，切片，he染色。15 d后，将仍然存活的小鼠颈椎脱臼法处死，处死小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏的操作同前。将组织匀浆培养得到的菌株，利用小琼脂块培养法进行初步鉴定。提取菌株dna，利用真菌通用引物(e1m4和re2m4)扩增线粒体细胞色素b基因片段〔6〕，并进行dna序列测定。将测定结果与genbank中烟曲霉序列进行比对，以验证该菌株是否为烟曲霉。以上实验重复3次。

1.2.6 烟曲霉致病力的比较

通过综合分析生存率、中位生存期、平均体重、肺组织匀浆的菌落计数及其组织病理学变化来比较7株烟曲霉的致病力。

1.3 统计学处理应用spss16.0软件对生存率进行log rank检验，对log (cfu/gram)进行方差分析。

2 结果

2.1 接种浓度的确定

接种烟曲霉jlc 50134 共7个浓度的孢子悬液，生存率计算结果见表1。发现浓度为1.0×107 cfu/ml时，在第3天50%的小鼠死亡，确定该浓度为实验接种浓度。