甲型肝炎IgM定性检测作业指导书

甲型肝炎IgM定性检测作业指导书

1.检验目的

血清抗HAV抗体IgM是HAV急性感染的标志，在感染的早期即已出现，是早期诊断甲型肝炎的依据。感染后3个月内可维持较高滴度，6个月后逐渐消失。

2.方法原理

采用ELISA架桥法，反应板的琼脂微孔包被兔抗人-IgMμ链，加入待测样本，同时加入HAVAg、抗-HAV-HRP，当样本中有抗-HAV-IgM时，会与包被在板上的兔抗人-IgMμ链结合，并被HAVAg 捕获、再与抗-HAV-HRP联接成复合物，加入底物TMB产生显色反应，反之则无显色反应。

3.性能指标

此方法快速简便、特异性强、检测灵敏度度0.5ng/ml。

4.标本收集

4.1 标本类型：静脉血或动脉血的血清或血浆标本均可作为检测标本

（抗凝剂可用肝素钠、枸橼酸钠、ACD、CPDA-1或EDTA，抗凝剂的质量应符合化试药品要求——化学纯或分析纯，使用的比例以厂家推荐为准）；其他体液如尿液、唾液、精液、羊水、胸水、

腹水、乳汁等体液可以作为检测标本，但加热灭活的血清和血库的库存血则不宜作为检测标本。

4.2标本留取：以空腹为宜，收到标本后最好立即离心留取血清或血

浆（凝固血应待其充分凝固后收集血清），不能有残留的红细胞、纤维蛋白丝，使用肝素治疗的病人宜在肝素治疗前抽血。

4.3 标本保存：留取的标本最好在3小时内检测，不能立即检测的应

放置于2-8℃最长达14天（可以含有凝块但要密闭以防蒸发），或者-10℃最长达14天（不能反复冻融也不能含有凝块和红细胞）。

4.4标本容器：盛放标本的容器必须为洁净的一次性真空采血管、玻

璃试管、一次性的不同规格的塑料离心管

4.5标本外送：如涉及到需要外送的标本，必须以规定的容器（0.5ml

塑料离心管）存放并密封，并根据邮寄规则和要求进行包装，运送时还要放入冰袋（2-8℃）或干冰（-10℃）由专人运送至指定地点指定接收人。

4.6拒收标本：凡与4.1-4.5所述内容不符的标本，检验人员应向临

床或就诊者说明拒收标本的原因，并提出解决的方案或建议。5.分析系统

5.1分析仪器：为美国BIO-RAD公司提供的MODEL550型酶标仪，仪

器校准请参见仪器操作规程。

5.2分析试剂：为上海科华公司提供的配套的HAV-IgM试剂盒，规格

为48test/盒，2-8℃贮存，有效期12个月；在效期内使用试剂。

5.3 质控试剂：为上海公司提供的配套的HAV-IgM试剂盒中所附带的

阴、阳性对照，2-8℃贮存，有效期12个月每月一次质控小结，失控要有记录及纠正的结果。

6.操作方法

6.1待测标本用生理盐水作1：1000稀释后加100μl于反应板微孔中。

6.2充分混匀，封板，置37℃孵育20分钟。

6.3手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗板后拍干。

6.4每孔加入HAVAg、酶结合物工作液各 1滴，充分混匀，封板，置37℃孵育20分钟。

6.5手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗板后拍干。

6.6每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37℃孵育才10分钟。

6.7每孔加入终止液1滴，混匀。

6.8用酶标仪读数，数值取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔 OD值。

7.质量控制操作程序

7.1每次实验设阴性、阳性各2孔，并设空白对照1孔随常规标本一起检测。

7.2质控结果登记到本年度的“免疫室定性检测项目室内质控登记表”。

7.3一旦发现失控，应即时查找和分析原因，并在该结果栏作详细的批

注和记录解决的过程；失控情况处理及原因分析详见8“失控处理”。

7.4每月进行质控小结。并将原始数据打印和存盘留档。

8.失控处理操作程序

8.1失控情况处理：操作者在分析质控结果时，如发现质控违背了控制规则，应填写失控报告单，上交专业室主管（组长），由专业室主管（组长）做出是否发出或重测与质控品相关的该批次病人标本检验报告的决定。

8.2失控原因分析：失控信号的出现受多种因素的影响，这些因素包括操作上的失误、试剂、对照物的存贮条件改变、仪器维护不良以及采用的质控规则、控制范围、一次测定的质控标本数等等。失控信号一旦出现就意味着与测定质控品相关的该批病人标本报告可能作废，此时首先要查明导致失控的原因，是对照物本身的原因还是对照物以外的原因。如是对照物以外的原因则应判为真失控，与对照物相关的同批次病人标本重新检测；如是对照物本身的原因，则判为假失控，与对照物相关的同批次病人标本不必重测，可以发出报告。当失控信号出现时，可以采取以下步骤去寻找原因：

8.2.1立即重测同一对照物。此法主要用于查明人为误差，每一步都应该认真仔细的操作，以查明失控的原因；另外，这一步还可以查出偶然误差，如是偶然误差，则重测的质控结果应在允许范围（在控），可以认为该批次的病人标本不必重测。如仍不在允许范围则可以进行下一步。

8.2.2新开一瓶对照物，重测失控项目。如果新开的对照血清结果正

常，那么原来那瓶对照血清可能过期或在室温放置时间过长而变质，或者被污染，此时可以认为该批次病人标本不必重测。如仍不在允许范围则可以进行下一步。

8.2.3进行仪器维护，重测失控项目。检查仪器状态，检查光源是否

更换，对仪器进行清洗维护，然后再测质控品，如在控，则说明是仪器原因，该批次的病人标本应重测。如仍不在允许范围则可以进行下一步。

8.2.4更换另一试剂盒，重测失控项目。检查试剂是否过期或贮存环

境，更换试剂盒重新检测对照物，如在控则说明试剂存在问题，该批次病人标本应重测。如仍不在允许范围则可以进行下一步。

8.2.5请专家帮助。前4步都未能得到在控结果，如果其他同类型检

验项目在控，则需要联系试剂厂家寻求技术帮助；如果其他同类型项目也失控，则需要与仪器厂家工程师取得联系了。

9.注意事项

9.1从冷藏环境中取出的试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔

反应条应置37℃平衡30分钟后方可使用，余者应及时封存于冰箱中以备后用.在平衡试剂的同时，待测标本应需置平衡30分钟后再行测试。

9.2使用前试剂应摇匀，并弃１～２滴后垂直滴加。

9.３封片不能重复使用。

9.４结果判断需在反应终止后10分钟内完成。

9.５不同批号的试剂不能混用。