工业微生物菌种开发的一般过程

1、工业微生物菌种开发的一般过程

自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。土壤样品的含菌量最多。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。

（1）采样

注意事项

1、采样时应尽可能保持相对无菌；

2、所采集的样本必须具有某种代表性；

3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；

4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；

（2）富集培养

目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。

例如控制培养基的营养成分的富集培养，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。

（3）分离筛选

经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。

例如划线分离法，用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。

（4）产物鉴别

经典微生物分类鉴别

现代的分子生物学分类鉴别

2、分子生物学分类方法（微生物分类鉴定的经典和现代方法）

DNA指纹技术，通常指那些以DNA为基础的分型方法，对微生物的种进行鉴别的技术。

（1）RFLP分析法（限制性酶切片段分析法）

提取全细胞基因组DNA，用限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析限制性酶切片段长度多型性。缺点是DNA酶切片段往往较复杂，难以比较。

（2）LFRFA分析法（低频限制性酶切片段分析）

选用专一识另6-8个碱基序列的限制酶内切，则DNA片段数量大大减少。但这样的DNA片段大大不能用琼脂糖凝胶电泳分开，只能用脉冲场凝胶电泳分开。

（3）核酸分子印记分析法

DNA酶切后电泳，然后转移到膜上与标记的rDNA探针进行杂交的一种方法。

（4）PCR技术

（5）RNA同源性分析

1）16sRNA

2）构建进化树

3）rDNA转录间隔区序列分析

4）随机扩增的多样性DNA

4、嗜热微生物的高温分子适应性

嗜热微生物：最适生长温度在45℃以上的微生物

超嗜热微生物：最适生长温度在80℃以上的微生物

（1）细胞内分子的结构变化所造成的分子相互综合作用是嗜热微生物耐热的直接原因

（i）tRNA分子内G-C对增加而变得稳定，平均3个A-U对碱基换成G-C对时，Tm值就会升高7-8℃左右。例如，嗜热栖热菌的G-C为90%左右（T m值86-88℃），而大肠杆菌的为65-87%（T m值77-83℃）。

（ii）另一方面，嗜热菌内的许多酶蛋白与细菌的耐热性有直接关系。如磷酸甘油醛异构酶在亚单位之间的相互作用乃是耐热的基础之一。

（2）外界环境中的保护因子

组成型保护因子：特定金属离子或低分子物质与细胞内分子相结合时会导致细菌的耐热性，如Ca2+对于蛋白和淀粉酶。

诱导型的保护因子：多胺，对于高度嗜热菌的蛋白质合成系统的保护作用。

（3）通过生物化学修饰反应获得耐热性

1）酶分子关键氨基酸的变化即可形成不同的折叠方式从而对热环境产生适应性。

2）通过蛋白中氨基酸上的负电荷与环境中的Na+等正离子之间形成盐桥数目的增加

3）膜脂具有高饱和度的脂肪酸，形成更强的疏水键，使细胞膜可在高温下保持稳定性和功能性。

4）某些小分子量相容性溶质的积累也有利于加强超嗜热蛋白的稳定性。如一些甲烷古菌在高温环境下细胞中含有环2,3-二磷酸甘油酸的大量积累。

5）某些特殊蛋白对于上限高温时的生长也是必须的

6）其它耐热机制还有：尽量减少蛋白与环境接触的表面积、增加蛋白的堆积密度从而减少疏水核心的空腔、增加蛋白核心的疏

水性、多亚基的蛋白更有利于热稳定的维持等。

5、嗜冷微生物分子适应性

嗜冷菌：产生一些在低温下行使功能而在正常温和条件下却变性或失活的酶类；在低温下嗜冷菌的主动运输系统运行良好。

主要是因为：细胞膜的特殊结构组成（高比例的不饱和脂肪酸）。

（1）冷激蛋白和冷激响应

微生物从最适生长温度迁到最低生长温度时，细胞内绝大多数蛋白质的合成暂时关闭，细胞生长暂时停止或延迟。此时冷激响应被诱导，产生一组细胞在低温下恢复生长所必需的冷激蛋白。解决了两个问题：一是细胞膜流动性降低，对细胞膜的生理功能的影响；二是RNA和DNA的二级结构被固定，对复制、翻译、转录的影响。

（2）蛋白质结构

嗜冷性的基础主要是在于蛋白质的结构。存在引起具有特殊活性的“冷”稳定酶。比相应的中温菌的酶要低20-30℃，有些酶的最适温度在15-20℃。

（3）嗜冷菌的核糖体蛋白特别适合于在低温下行使功能。

（4）当细菌长期处于低温环境时，另一套蛋白将被合成，即冷适应蛋白。

5、嗜酸微生物分子适应性

（1）极端微生物对酸环境的适应性不需要全细胞的适应，只需要通过膜蛋白和离子泵通道即可达到适应的目的。虽然嗜酸菌生长的外部环境呈酸性，但细胞内部的pH接近中性，胞内酶系和代谢过程通常与中性菌相似。

（2）对于常温型G-嗜酸菌，其细胞周质中酶蛋白含量较高，这些酶的定位对于酸性环境的适应性有重要作用。

（3）相对低的电荷密度导致了在酸性pH环境的稳定性。

（4）细胞膜。当pH上升到中性时，专性嗜酸菌的质膜会裂解，高浓度的氢离子实际上对膜的稳定性是必需的。具有排阻外来H+和排除细胞内H+的能力。

6、嗜碱微生物分子适应性

除了碱性环境外，几乎所有嗜碱芽孢杆菌的生长、发芽以及芽孢形成都需要钠离子的存在。当细胞质的pH 维持在正常生长范围时，Na+/H+逆向运输泵的排Na+摄H+的活性很低；当细胞质的pH 高于正常生理范围时，Na+/H+逆向运输泵变得非常活跃，排Na+摄H+的活性也变得非常高。这一循环的结果导致细胞质pH 的稳定。

7、嗜盐微生物分子适应性

在高盐环境中的微生物必需具有一些避免由于渗透作用而丢失水份的机制。

在细胞水平上，

（I）“以毒攻毒”的策略。在细胞内积累大量盐离子（主要是钾离子），同时排出钠离子。

（II）在细胞内产生或积累大量的小分子有机物质（即相容性溶质）进行响应，即抵消高盐环境外部渗透压。

在分子水平，需要高离子浓度来维持细胞形态和完整性。其细胞质膜这外具有一层六角形亚单位的排列（称S-层）。S-层由硫酸化的糖蛋白组成，因此带有负电荷，细胞完整性需要高盐离子浓度的性质与糖蛋白亚基排斥力的电荷屏蔽作用有关。