拟南芥

姓名沈一鸣班级生技3班同组人无
科目遗传学实验题目拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定组别无
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一、实验目的
1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异；
2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。

二、实验原理
拟南芥（Arabidopsis thaliana）：十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物
学的模式植物
拟南芥特点：
1)植株形态个体小，高度只有30cm左右；
2)生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；
3)种子多，每株可产生数千粒种子；
4)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；
5)遗传转化简单，转化效率高；
6)基因组小，只有5对染色体，125MB；
7)在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物
突变体是遗传学研究的最重要材料。

自然突变
突变体的获得
人工诱变
拟南芥诱变常用方法：
EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量
的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

T-DNA插入突变原理：
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA（transferred DNA ）。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。

如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体：
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离
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科目遗传学实验题目拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定组别无
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PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。

它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP 和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。

经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；
在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。

因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。

DNA提取原理：
分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基因克隆、基因定位）的第一个步骤。

不同的研究目的对DNA的纯度和产量要求不同。

如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态(RFLP)等对纯度要求高；
用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的污染物；
用于遗传标记分析的DNA，纯度要求低但产量则要高。

DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断DNA双链。

提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物总DNA提取与鉴定。

本实验采用CTAB法。

CTAB的主要作用是破膜。

CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。

在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。

因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。

酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。

异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA失水而聚合沉淀。

三、实验材料
拟南芥T-DNA插入突变体分离群体35个单株。

四、实验步骤
CTAB提取液（1000 ml）组成：
20 g 1 M Tris-HCl pH 8.0
40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
81.8 g NaCl
0.2%(V/V) β-巯基乙醇
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—————————————————————————————————————————————————————注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
酚/氯仿/异戊醇：25：24：1
氯仿/异戊醇：24：1
TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
3 M NaAc（pH 5.2）
植物DNA提取方法（CTAB法）：
(1) 水浴加热CTAB提取液至65℃;
(2) 取叶片100mg, 液氮研磨成粉末;
(3) 加入600µl CTAB提取液并混匀;
(4) 65 ℃水浴45min（至少30min）;
(5) 12,000rpm 离心10min;
(6) 将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇, 混匀;
(7) 12,000rpm离心5-10min, 将上清液转移到新管中；
(8) 向上清中加入等体积异丙醇或2V无水乙醇, 混匀冰上放置10min;
(9) 12,000rpm 离心10min，弃上清，加入500µl 70％乙醇洗涤2min
(10) 12,000rpm 离心5min，弃上清，吸干残留并干燥
(11) 加20-50 µl TE缓冲液溶解DNA
PCR 反应体系：
H2O 12.3 μl
10×Buffer 2 μl
dNTP 0.5 μl
MgCl2 2 μl
LP/BP 0.5 μl
RP 0.5 μl
Taq 0.2 μl
DNA 2 μl
Total 20 μl
94℃5min
94℃30s
53℃30s
72℃1min20s
35 cycle
72℃7min
五、实验结果
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泳道4为我的拟南芥的DNA，泳道5为引物BP和RP扩增的PCR产物，泳道6为引物LP和RP扩增的PCR产物，
泳道13为DNA marker
泳道4的各个条带亮度较高，可能是我提取的DNA量比较多的结果；可以看到以BP和RP 为引物扩增的PCR产物（5号泳道）产生了一个较小的条带，而以LP和RP为引物扩增的PCR产物（6号产物）没有产生较大的条带，所以可以推断我所用的拟南芥突变纯合体。