拟南芥转化

我转化拟南芥的主要实验步骤如下：
1、将-20保存的菌液加入10mLYEB(Kan20+str20+Rif40)中，假如比例为1：100，然后在
28度250rpm的摇床培养大概两天，再将哦诶样所得的菌液按1：100的比例加入250mL
新鲜的YEB中继续按上述条件培养，大概16h后取出并在4度5000rpm离心5min收集菌体，
倒掉上清，用250mL转化液悬浮菌体。
2、转化液的配制：MS粉2.21g/L+蔗糖5g/L+Silwet L-77 0.1% (用氢氧化钠调PH至5.8)
3、转化前一天将植株浇透。
4、第一次将花序浸入转化液中20s，然后直接放入温度适宜的培养箱暗培养18-24h，5-7天后第二次浸染我直接有枪将转化液滴在花蕾上然后暗培养，要说明的是我两次浸染后都没有保鲜膜包住植株保湿。
anne9000 发表于 2008-4-24 15:45

楼上说的很详细了，我再补充几个要点：
1、一定要加silwet-77
2、如果你最后配成的渗透液浓度大，侵染过夜后要用清水冲洗花序，如果浓度不大，就不用了。
3、我侵染了1分钟左右。
4、侵染后花盆要平放。
5、你用的载体是什么抗性？你的筛选培养基需要先做个实验，确定植株和载体对抗生素的耐受浓度。我做的实验，资料显示KANA浓度需要50mg/ml。最后事实证明是40。
6、一般潮霉素抗性，是大苗和小苗的差别，如果用卡那抗性，没有转进去的会变成白化苗，一般见光7天后就可辨认出来。一分辨出来就移栽，不要让呆很长时间。
朝天椒 发表于 2008-4-25 12:06

看了楼主的步骤，我们用的转化液就是MS加蔗糖,加silwet-77没有调pH。侵染时间1-3min，侵染后花盆平放覆保鲜膜并黑暗培养24h后正常条件培养至结果，无需第二次浸染，浸染一定要彻底，保证每朵花蕾都被浸染。我认为最关键的不是用什么浸染怎样浸染，而待转化拟南芥的生长状态，一棵强壮的植株可以获得几十棵阳性，而几十棵弱小植株也无法获得一棵阳性苗。
yunjingli 发表于 2008-4-28 11:09

首先谢谢
我也即将要转化拟南芥了
看了之后帮助很大，目前我们实验室在这块不是很健全，我想请教一下在拟南芥转化后得到To代株系后，用卡拉霉素怎样进行筛选，然后怎样把阳性的植株栽倒土里，成活率会提高。
hnanng 发表于 2008-4-29 14:34

我做的过程中发现暗培养的条件不能太长。长了就可能结实不多影响转化效率
bioflower 发表于 2008-4-29 19:59

学习学习，原来也做过，过程差不多
臭妞妞 发表于 2008-4-30 15:04

各位，有没消毒拟南芥转化子的标准程序啊？偶将不胜感激啊！
wen0891 发表于 2008-4-30 17:18

以前用过抽真空法，效果并不好，后来直接沾花
我的转化液只有蔗糖和silwet-77
我一般先挑菌小摇，之后再扩繁，其实YEP还是LB差别不是很大
摇

好的菌液OD在1.5--3之间，加转化液后0.75-1.5.
最重要的就是苗的状态，有时候长的好的苗三四棵就足够的