拟南芥转化
拟南芥转化 浸花法
拟南芥转化—浸花法实验步骤：关键记录：a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。
b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。
c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。
一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。
d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。
e.干燥成熟的果夹用小袋套住。
f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。
说明：如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。
如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。
去掉用于转化植株上的果夹。
具体步骤：1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。
2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。
注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。
确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。
3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。
浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。
混匀，转移至50ml离心管。
注意：表面活性剂浓度过高有毒害。
为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。
在双转化试验中我们至少要用48株植株。
间隔7天进行第二次浸染植株。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
拟南芥转化简易操作
拟南芥转化简易操作（滴染）热带农科院热带生物所的庞永奇向我们介绍了一种拟南芥转化的简易操作。
背景：拟南芥转化大体分为浸花、喷洒及滴染几种，主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染，使用中各有优缺。
本人在研究中感觉滴染效果较好，并在实践中做了些简略与细化。
方法改进：摇菌3～5mL过夜，1.5mL管集3mL菌，以1mL渗入缓冲液（1/2MS大量、5%（W/V）蔗糖、0.02～0.05%silwet L-77）重悬，吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处。
做好标记后直接放回光照培养。
一周内对所转植株进行二次重复侵染转化。
约两三周会有第一批几个荚成熟，直接取了进行筛选，效果好的话一般可以筛到几株至几十株阳性苗。
后续的种子当然也要收着。
结果：一般情况下只需转化2～8株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系。
单株可以分不同侧枝进行，效果也还不错。
一定要注意苗的生长状况，温度失控、虫害以及打药都可能造成不得影响。
新配的悬浮液浸润效果要好些，浸花时要保证溶液浸入。
http:/newsf/2010-8/2010820173025393.htm拟南芥转化（浸泡）1.准备工作：250mL LB（装锥形瓶中）500mL 5%蔗糖50mL离心管5-6个灭菌转化一般在剪花后一周左右烧杯（500mL）、玻璃棒2.（1）农杆菌活化 5 mL LB +15uL Rif(20mg/mL)+3.75uL Kan(100mg/mL)+200uL菌液。
即：5 mL LB液中（含Rif 60ug/mL;Kan 50ug/L）。
28℃摇床过夜。
（2）将活化的农杆菌液转至250uL LB液中。
LB（250mL）+750uL Rif +187.5uL Kan +5mL预培养的菌液，28℃摇1-2d,至色。
（3）5000rpm;10min. 去上清，加5%蔗糖悬浮沉淀（剩一两管）加至烧杯，混匀，调OD值为0.5—0.8之间（0.7—0.8为最佳）加150uL表面活性剂silwet，混匀浸泡花90s包上保鲜膜，倒放16—24h,保湿正常培养，收种种子的筛选：MS板加入50uL/mL Kan 即可。
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化是利用其遗传特性实现不同的目的的一项技术。
通常来说，拟南芥的花浸渍转化方案分成三个步骤：1）花粉培养 2）植物体系建立 3）转基因表达系统构建。
首先，在进行拟南芥花浸渍转化方案时，花粉培养是必不可少的一个步骤。
在该步骤中，
一般利用磷酸三钠、核酸抗凝剂、复合氮肥和碳源构建适宜的花粉培养基，利用此基础培养拟
南芥花粉以便获得正常受精细胞。
其次，完成花粉培养和受精细胞形成后，将进行植物体系的建立。
在此步骤中，需要构筑
一个适宜的植物大培养体系，一般以磷酸铵、硝酸钾、硫酸钙和无机氮构建营养基，并加入2％的半乳糖等激素以利于受精细胞的胚胎发育，建立起适宜的植物体系。
最后，构建转基因表达系统，这是拟南芥花浸渍转化中最重要也是最复杂的一步。
常用的
基因载体可以分为普通的DNA质粒和Agrobacterium质粒载体，其中保护基因所需的抗生素
标记也不相同，它们分别是：对于普通的DNA质粒，采用Kanamycin标记；而对于Agrobacterium质粒载体，采用Bastinomycin标记。
在此步骤中，我们还需要将培养好的转
基因拟南芥细胞接种到拟南芥的植株上，以便获得转基因拟南芥以及转基因表达分析。
总之，拟南芥的花浸渍转化方案具有较强的通用性，可以用于实现拟南芥的转基因技术。
此外，拟南芥的花浸渍转化方案分为三个步骤：花粉培养，植物体系建立和转基因表达系统的
构建。
与传统的转基因技术相比，拟南芥的花浸渍转化方案具有更快的获得转基因拟南芥的速度，同时也具有更高的成功率，可以为科研活动提供更高的效率和更好的效果。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
拟南芥转化
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
拟南芥原生质体转化
拟南芥原⽣质体转化在短⽇照，相对低光和⾼湿的条件下种苗⼦。
（10-13 h light at 23°C/11-14 h dark at 20°C）（50-75µmol m-2 S-2），湿度40-65%。
选择3-4周的苗⼦，没有开花，没有胁迫，⼀般第5-7⽚真叶已经完全展开。
选取第5,6,7⽚真叶，⽤锋利的⼑⽚切下，在实验台上，先把叶⽚的边缘切掉，然后将叶⽚的中间部分切成0.5-1mm 的细条，将切好的细条两⾯都沾到酶解液，浸泡到酶解液Enzyme solution中。
28°C⿊暗消化叶⽚5 h。
⼀般10⽚叶⽚⾜够做20个样品的。
向消化好的叶⽚中加⼊等体积的W5 solution（10 ml 酶解液加10 ml W5），轻轻混匀，⽤筛⼦将消化的原⽣质体过滤到50ml的圆底离⼼管中。
4°C，200 g，soft离⼼2 min，使原⽣质体沉到管底，去除上清，轻轻旋转离⼼管，使原⽣质体分散。
（⼤离⼼机上升下降的加速度设成5）.沿管壁向原⽣质体中缓缓加⼊5 ml的W5 solution，轻轻混匀后，冰上放置30 min，使原⽣质体靠重⼒沉降。
尽量去除上清，但不要碰到原⽣质体的沉淀，之后加⼊样品需要体积的MMG solution。
轻轻混匀，冰上放置。
分装10 µl质粒到2 ml的圆底离⼼管中，加⼊100 µl的原⽣质体，轻轻拨匀，之后沿管壁轻轻加⼊110 µl预先配好的PEG-calcium transfection solution，轻轻拨匀。
室温静置5-15 min。
向管中加⼊400-440 µl的W5 solution，轻轻颠倒混匀，终⽌转化反应。
RT，100 g，soft 离⼼2 min，之后去除上清。
⽤1 ml的W5 solution重悬原⽣质体。
将离⼼管放到光下培养过夜。
光下培养有利于某些基因的表达，但强光会破坏原⽣质体的⽣长，最后在培养的时候上⾯盖上两层卫⽣纸。
浸花法转化拟南芥
浸花法转化拟南芥拟南芥受体材料选择：将拟南芥种植在16h/8h 光照/黑暗条件，20℃到22℃，拟南芥移栽后大约两周进入花期，如果剪去主苔，侧苔大约需要1-2周进入花期；待其刚刚开花，只形成1-2个角果时，即可用于转化，此时花蕾状态最佳。
转化前将角果及已完全开放的花蕾剪去，仅留下刚刚露白及幼嫩花蕾。
浸花法转化拟南芥①接种单个菌落于5 mL YEB培养基（利福平10 μg/mL，卡那霉素100 μg/mL）中，培养过夜；②1：100扩培到500 mL YEB的锥形瓶中，继续摇培12 hr左右至生长密度为OD600值1.0-1.2；③室温，5500 g离心15 min收集菌体；④用转化介质(0.5×MS大量元素，1×MS微量元素，1×铁盐，1×MS有机，5%的蔗糖，0.05% Silwet L-77，0.5 g/L MES，1X B5 vitamins ,0.01 mg/L 6-BA，pH 5.7)悬浮菌体密度至OD600为0.8左右；⑤将含有农杆菌的转化介质倒入100 mL烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序连同莲座基部的叶片都浸入转化介质中，（抽真空？）维持5 min；如果再次侵染，一般两次侵染之间间隔时间为6-7天比较好。
⑥取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿恢复24 hr；⑦将拟南芥扶起，培养液浇透后，放在光下正常培养，转化后植株正常的开花生长，3-4周待长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。
注：1、YEB培养基：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L，Yeast extract (酵母膏) 1g/L，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ，MgSO4·7H2O 0. 4g/L，Agar (琼脂) 15g/L，pH 7.4（《分子克隆实验指南》校对）2、MES：2-(N-Moropholino)ethanesulfonic acid，2-(N-吗啡啉)乙磺酸，用于配制细胞培养和酶学测定生物缓冲液。
拟南芥转化流程
拟南芥转化流程拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。
拟南芥转化是指将外源基因导入拟南芥的过程，通过转化技术，可以使拟南芥表达特定的基因，从而研究基因功能、调控机制以及植物生长发育等方面的问题。
下面将详细介绍拟南芥转化的流程。
一、前期准备工作在进行拟南芥转化之前，首先需要准备一些实验材料和试剂。
这些包括拟南芥种子、培养基、细菌菌株、质粒载体等。
同时还需要准备一些实验器材，如离心管、琼脂糖凝胶、PCR仪等。
二、质粒构建在进行拟南芥转化之前，需要构建含有目标基因的质粒。
质粒通常由多个部分组成，包括启动子、目标基因、选择标记等。
在构建质粒时，需要使用PCR技术扩增目标基因，并经过酶切、连接、转化等步骤，最终得到完整的质粒。
三、细菌转化和筛选构建好的质粒需要通过细菌转化来扩增。
将质粒导入适当的细菌菌株中，利用培养基和培养条件培养细菌，使其扩增质粒。
之后，通过筛选等手段，得到含有目标质粒的细菌菌落。
四、DNA提取和验证从筛选出的细菌菌落中提取质粒DNA，可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行提取。
提取得到的DNA需要进行酶切鉴定，通过PCR扩增目标基因进行验证。
同时，还可以使用限制性片段长度多态性（RFLP）等技术对质粒进行进一步的验证。
五、拟南芥转化得到验证合格的质粒后，就可以进行拟南芥转化了。
常用的转化方法有农杆菌介导法和冷冻法。
在农杆菌介导法中，将构建好的质粒导入农杆菌中，然后将农杆菌与拟南芥叶片进行共培养，利用农杆菌的侵染能力将质粒导入拟南芥细胞中。
而冷冻法则是将拟南芥种子与农杆菌共同处理，通过冷冻和解冻的过程，使质粒导入拟南芥种子中。
六、筛选和培养转化完成后，需要对转化成功的拟南芥进行筛选和培养。
通常会在培养基中添加适当的选择标记，如抗生素等，以筛选出含有目标基因的拟南芥植株。
筛选出的植株可以继续培养，在适当的生长条件下进行生长发育观察和功能验证。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
浸花法转化拟南芥原理
浸花法转化拟南芥原理
植物细胞的原生质体在体外培养时，其分裂和生长均比较缓慢，一般不能长成成熟的植株。
但如果将植物细胞的原生质体用不同的化学溶液浸泡，使其发生形态上的变化，然后再接种于适当的培养基中，这种由植物细胞原生质体产生的后代就会发育成植株。
实验过程
将含有目的基因的拟南芥子细胞直接接种于含拟南芥花粉培养基上，如根瘤菌培养基（含有一定浓度的根瘤菌菌体和植物激素），一段时间后，可以观察到子叶萌发成苗，并可将生长出的植株通过有丝分裂再转化为植株。
原理解释
这种方法实际上是一种离体转化技术，其实质就是用化学试剂把拟南芥子细胞中的分裂原变成生长因子。
生长因子在植物细胞内有两种形式：一种是活细胞因子，它在活细胞内起着调节细胞分裂和生长的作用；另一种是死细胞因子，它在细胞死亡时才释放出来，如核黄素（维生素B2）、氯霉素（抗生素）等。
采用浸花法转化拟南芥原理，可以把拟南芥子细胞中的活细胞因子激活并释放出来。
—— 1 —1 —。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml 大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
拟南芥的遗传转化
用移液器转移到吸附柱 CP3 中，注意 尽量不要吸出沉淀。12，000 rpm 离心 30s，倒掉收集管中的废液；第六，向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 300μl 漂 洗 液 PWT，12，000 rpm 离心 30s，倒掉收 集管中的废液；第七，重复步骤六； 第八，将吸附柱 CP3 放入收集管中， 12，000 rpm 离心 1 min，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除；第九，将 吸 附 柱 CP3 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中，向吸附膜的中间部位滴加 50μl 洗 脱缓冲液 TB，12，000 rpm 离心 30s 将 质粒溶液收集到离心管中。进行质粒 提取后，用两个内切酶 Bgl II 和 Pml Ι 分别对 pGM－T－目的基因的质粒和 pCAMBIA3301 载体进行双酶切。加样 结束后，混匀，37℃酶切 10h。酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳，且对目标片 段及 pCAMBIA3301 骨架进行胶回收。 然后，通过连接酶对目标片段和 pCAMBIA3301 骨架进行连接，构建重 组表达载体。转化大肠杆菌 Trans 5α感 受态，挑斑、摇菌，进行菌液 PCR 检 测。挑取阳性 pCAMBIA3301－目的基 因克隆提取质粒，进行双酶切验证和 测 序 。 测 序 正 确 后 ， 阳 性 pCAM⁃ BIA3301－目的基因克隆质粒转化农杆 菌 EHA105 感受态。
学术探讨
XU E SHU TA N职业学院 刘晓丽 魏 楠
摘 要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生 型拟南芥中。通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合 T3 代转基因株系。后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南 芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
拟南芥原生质体分离及转化实验方法
拟南芥原生质体的分离与转化1．需要准备的器材名称名称名称剃须刀片75um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形离心机（水平转子）滤布瓶圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2材料准备拟南芥品种为哥伦比亚，培养条件23°，10-13小时光照；20°，11-14小时黑暗培养3-4周左右。
3原生质体分离（1）选取开花前3-4周的拟南芥（5-7片真叶时）分离原生质体，用锋利的刀片切成大约0.5-1mm宽的细丝；10-15片叶子需要5-10ml的酶解液；切开后立刻转移到酶解液中，叶片充分浸没在酶解液中（3）避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光室温酶解至少3小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）,用显微镜观察释放的原生质体状态；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用75um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）100g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清。
（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加入适量W5重悬，冰浴30min；（9）弃上清，加适量MMG溶液重悬。
原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的20% PEG溶液，混匀，室温避光放置5-7分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，100水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或22℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
拟南芥转化
1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于 5 ml含100 µg/ml利福平(Rifampicin)，50 µg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 µg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 µl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 µl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。
2.质粒转化农杆菌GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；3) 液氮冷冻8 min；4) 37℃水浴热激5 min；5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。
经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。
（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
拟南芥原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法整理一、土培室播种种植的拟南芥。
二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。
三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm 宽的叶条。
四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml 酶解液大约需10-20 片叶子）。
并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。
（此时可配制PEG400C溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。
）六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少 3 个小时。
当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。
（此时预冷一定量W5容液）七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。
八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5容液稀释含有原生质体的酶液。
九、先用W5容液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
十、用30 毫升的圆底离心管100g，1-2 分钟离心沉淀原生质体。
尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5容液轻柔重悬原生质体。
十一、在冰上静至原生质体30分钟。
以下操作在室温23 C下进行十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。
在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5容液。
然后用适量MM溶液（Im）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
十三、加入10 ul DNA （10-20微克约5-10kb的质粒DNA至2ml离心管中。
十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
十五、加入110 ul PEG 溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10 个样品）。
十六、诱导转化混合物5-15 分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。
十七、室温下用400-440 ul W5 溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。
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2、转化液的配制：MS粉2.21g/L+蔗糖5g/L+Silwet L-77 0.1% (用氢氧化钠调PH至5.8)
3、转化前一天将植株浇透。
4、第一次将花序浸入转化液中20s，然后直接放入温度适宜的培养箱暗培养18-24h，5-7天后第二次浸染我直接有枪将转化液滴在花蕾上然后暗培养，要说明的是我两次浸染后都没有保鲜膜包住植株保湿。
以前用过抽真空法，效果并不好，后来直接沾花
我的转化液只有蔗糖和silwet-77
我一般先挑菌小摇，之后再扩繁，其实YEP还是LB差别不是很大
摇好的菌液OD在1.5--3之间，加转化液后0.75-1.5.
最重要的就是苗的状态，有时候长的好的苗三四棵就足够的
我转化拟南芥的主要实验步骤如下：
1、将-20保存的菌液加入10mLYEB(Kan20+str20+Rif40)中，假如比例为1：100，然后在
28度250rpm的摇床培养大概两天，再将哦诶样所得的菌液按1：100的比例加入250mL
新鲜的YEB中继续按上述条件培养，大概16h后取出并在4度5000rpm离心5min收集菌体，
6、一般潮霉素抗性，是大苗和小苗的差别，如果用卡那抗性，没有转进去的会变成白化苗，一般见光7天后就可辨认出来。一分辨出来就移栽，不要让呆很长时间。
朝天椒 发表于 2008-4-25 12:06
看了楼主的步骤，我们用的转化液就是MS加蔗糖,加silwet-77没有调pH。侵染时间1-3min，侵染后花盆平放覆保鲜膜并黑暗培养24h后正常条件培养至结果，无需第二次浸染，浸染一定要彻底，保证每朵花蕾都被浸染。我认为最关键的不是用什么浸染怎样浸染，而待转化拟南芥的生长状态，一棵强壮的植株可以获得几十棵阳性，而几十棵弱小植株也无法获得一棵阳性苗。
yunjingli 发表于 2008-4-28 11:0，目前我们实验室在这块不是很健全，我想请教一下在拟南芥转化后得到To代株系后，用卡拉霉素怎样进行筛选，然后怎样把阳性的植株栽倒土里，成活率会提高。
hnanng 发表于 2008-4-29 14:34
我做的过程中发现暗培养的条件不能太长。长了就可能结实不多影响转化效率
bioflower 发表于 2008-4-29 19:59
学习学习，原来也做过，过程差不多
臭妞妞 发表于 2008-4-30 15:04
各位，有没消毒拟南芥转化子的标准程序啊？偶将不胜感激啊！
wen0891 发表于 2008-4-30 17:18
anne9000 发表于 2008-4-24 15:45
楼上说的很详细了，我再补充几个要点：
1、一定要加silwet-77
2、如果你最后配成的渗透液浓度大，侵染过夜后要用清水冲洗花序，如果浓度不大，就不用了。
3、我侵染了1分钟左右。
4、侵染后花盆要平放。
5、你用的载体是什么抗性？你的筛选培养基需要先做个实验，确定植株和载体对抗生素的耐受浓度。我做的实验，资料显示KANA浓度需要50mg/ml。最后事实证明是40。