支原体污染后的处理方法

组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：
控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。

当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。

目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。

另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。

去医院买一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，国产的很便宜，在超净台内打开，可直接往培养瓶里加，混匀，终浓度为10ug/ml，细胞连续用药两周，即OK。

也可试20，10，5，高中低三个浓度，慎重些。

本实验室多人试过，效果很好，且一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，稀释量很大，能用于大量大量的细胞，经济实惠，最穷的人也用的起。

《细胞培养的微生物污染排除》
一、抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体1．抗生素制备：均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。

2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。

3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。

4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。

5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。

BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。

二、加温除菌法：把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。

三、动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

四、巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。

在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

支原体污染的检测
支原体(Mycoplasma)直径在0.2um左右，是一种无细胞壁、具有高度异型性、可以穿过常规除菌滤膜的最小的原核生物。

由于它无细胞壁，故对理化因素(如65℃下灭活、普通清洁剂和消毒剂处理)都比较敏感。

支原体依靠附着在宿主细胞表面，与细胞竞争培养液中的单糖、氨基酸和核酸前体物质而繁殖生长。

受支原体污染的培养细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不混浊。

由于对支原体污染难以观察到特殊的外观变化，要在污染的早期进行发现和处理是相当困难的。

在细胞培养过程中，如果在显微镜下发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受支原体污染。

必要时应借助有关检测技术对培养物进行特殊检测，如DNA荧光染色法、聚合酶链反应方法、免疫学方法、以及支原体培养法
A. DNA荧光染色法
该法的基本原理是，利用能与DNA相结合的荧光染料(如Hoechst 33258)对细胞进行染色，无支原体污染的细胞，DNA只存在于细胞核内。

而污染了支原体的细胞，由于支原体附着在细胞表面上，可以呈现核外的点状或网状荧光。

核外荧光的密集度与支原体污染的程度成正比。

据此可以在荧光显微镜下判断支原体污染及其程度。

(1) 主要实验材料：
①pH7.2的PBS缓冲液500ml；
②Hoechst 33258染料储存液(100×，用PBS配成浓度为500ug/ml)；
③由乙酸和无水甲醇按1:3混合后配成的固定液，置4℃下备用。

(2) 染色过程：
①将待检测细胞接种到盖玻片上，用无抗生素的培养液培养3～4d。

②取出生长着细胞的盖玻片，用冷风吹干。

③用固定液浸泡盖玻片，固定细胞10min。

如果培养物为悬浮生长的细胞，可将细胞离心沉淀，用PBS调节细胞密度至1×106/ml，在盖玻片上制成细胞涂片后，经冷风干燥，再进行固定。

④用pH7.2的PBS稀释Hoechst 33258染料储存液，使最终浓度为5ug/ml。

将染液数滴加到固定好的细胞上，在室温下染色30min。

⑤用pH7.2的PBS浸洗染色后的盖玻片3次，每次3～5min。

⑥将1滴含1%甘油的PBS加到染色后的细胞表面。

将盖玻片有细胞的一面朝下覆盖在载玻片上。

⑦将载玻片置荧光显微镜下，观察细胞的荧光分布状态，判断是否有支原体污染及其程度。

(3) 结果判断：
无支原体污染的细胞只有细胞核才显示荧光，污染了支原体的细胞不仅在细胞核而且在细胞核外及细胞膜上均显示荧光。

荧光呈点状或网状，密集程度与污染呈正相关。

用此方法对支原体污染的检出率可以达到95%。

B. 聚合酶链反应方法(PCR)
聚合酶链反应方法(Polymerase Chain Reaction, PCR)是伴随分子生物学技术的发展而建立的一种快速敏感的支原体检测方法。

它模拟自然DNA复制方式在体外实现DNA扩增。

利用已设计好的对支原体特异的16SrRNA基因引物或16S～23SrRNA基因间隔区的引物，可以检测到样品中极少量的支原体DNA(刘江等，1996)。

其敏感性比支原体培养法高1000倍。

以PCR方法检测支原体的试剂盒现在已有商品供应，它提供了特异的引物、Taq酶、缓冲液以及dNTPs等。

根据常规PCR反应原理和实验步骤即可完成对培养物中支原体的快速检测。