无菌检查法

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无菌检查法(2010版)
• 供试品接种及培养基接种 • 薄膜过滤法 采用封闭式薄膜过滤器,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径约为 50mm,根据供试品及其容剂的特性选择滤膜材质。使用时应保证滤 膜在过滤前后的完整性。 • 水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜,油类供试品, 其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率, 应注意保持供试品溶液和冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品溶液经 薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗,每张滤膜每次冲洗量一般为 100mL,总冲洗量不得超过1000mL,以避免滤膜上的微生物受损伤。 • 水溶液供试品:取规定量,每支(瓶)供试品装量为5mL及以下者, 全部转移至含适量稀释液的无菌容器内,混匀,立即过滤。 • 水溶液固体供试品:取规定量,加适宜的稀释液溶解或按标签说明 复溶,然后按水溶液供试品项下的方法操作。
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2015版与2010版药典无菌检查法对比
改变项目 无菌检查环境 2015版 环境洁净度B级背 景下的局部A级洁 净度 硫乙醇酸盐流体 培养基(FT)和 胰酪大豆胨液体 培养基(TSB) 每批取不少于5支 (瓶) 2010版 环境洁净度10000 下的局部洁净度 100级 硫乙醇酸盐流体 培养基和改良马 丁培养基 每批取10支(瓶)
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2015版与2010版药典无菌检查法对比
改变项目 方法适用性检查 2015版 2010版
菌种:金葡、枯草、生 菌种:金葡、枯草、铜 孢、大肠埃希菌、白念、 绿、白念、黑曲霉 黑曲霉
2015版药典三部保留了生物制品无菌检查法的特点,如检验数量、 硫乙醇酸盐流体培养基接种份数和培养温度等。 由于培养基的改变,培养基的灵敏度和方法适用性试验也进行了修 订。
M≥5g
半量
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无菌检查法(2010版)
• 无菌检查方法有直接接种法和薄膜过滤法,只要供试品性状允许, 应采用薄膜过滤法。若采用薄膜过滤法,接种过程应采用三联薄膜 过滤器,其中两联加入硫乙醇酸盐流体培养基,另一联加入改良马 丁培养基,只要供试品允许,应将所用容器内的内容物全部过滤。 • 阳性对照:以金光色葡萄球菌作为阳性对照菌。供试品用量同供试 品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照试验的菌悬液制备 同培养基灵敏度检查项下的金黄色葡萄球菌菌液制备方法,加菌量 小于100CFU。阳性对照也可在供试品无菌检查培养14天后,取其中1 份硫乙醇酸盐流体培养基,加入小于100CFU的阳性对照菌,作为阳 性对照。 • 阳性对照置30~35℃培养48 ~72小时应生长良好。 • 阴性对照:供试品无菌检查时,应取相应溶剂、稀释液和冲洗液同 法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 • 操作时,用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果供试品 容器内有一定的真空度,可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤器的针 头)向容器内导入无菌空气,再按无菌操作启开容器,取出内容物。
无菌检查法(Biblioteka 010版)• 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、生物制品、医药器具、原料、 辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规 定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 • 无菌检查应在环境洁净度10000下的局部洁净度100级的单向流空气区域 内或隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染, 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作 台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相 关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常 检验还需对实验环境进行监控。 • 无菌检查人员必须具备微生物专业知识,并经过无菌技术的培训。
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• 菌液稀释梯度的确定 用于灵敏度测定的菌液用相应的培养基进行计数,采用10倍梯度稀 释法(1 mL+9 mL=10-1),每个扩增好的菌液稀释到10-7,用于计 数的梯度为10-4~10-7,每个梯度用三个平行的培养基进行计数, 取平均值作为菌落数。金黄色葡萄球菌、枯燥芽孢杆菌、铜绿假单 胞菌用TSA平皿进行计数培养,30~35℃培养2天,生孢梭菌用硫乙 醇酸盐流体培养基进行计数培养,30~35℃培养2天,白色念珠菌、 黑曲霉用TSA平皿进行计数培养20~25℃培养3天。菌落数小于100 CFU的梯度下的菌液即为实验所需的菌悬液。 • 培养基接种 取每管装量为12 mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支,分别接种小于 100 CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢 梭菌各2支,另一支不接种,作为空白对照,置30~35 ℃培养3天; 取每管装量为9 mL的改良马丁培养基5支,分别接种小于100 CFU的 白色念珠菌、黑曲霉各2支,另一支不接种,作为空白对照,置 20~25 ℃培养5天。逐日观察结果。同时对相应梯度下的菌悬液进 行计数复核,每种菌做三个平行,以确保培养基接种的是小于100 CFU的菌液。
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无菌检查法(2010版)
• 培养及观察 • 将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份,一份置30~ 35℃培养14天;另一份与接种后的改良马丁培养基置20~25℃培养 14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品 后或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上 判断是否有菌生长,可取该培养基适量转种至同种新鲜培养基中及 营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上,细菌培养2天,真菌培养3 天,观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面上 是否有菌生长;或取培养液(物)涂片,染色,镜检,判断是否有 菌,必要时做菌种鉴定。 • 结果判定:阳性对照应生长良好,阴性对照应无菌生长。否则,实验无 效。 • 若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确认无菌生长,则判供试品符 合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确认有菌生长,判供试品 不符合规定,除非能充分证明实验结果无效,即生长的菌非供试品 所含。试验若经确认无效,应重试。重试时,重新取同量供试品, 依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定,若有菌生长,则判供 试品不符合规定。
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无菌检查法(2010版)
• 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物 至营养肉汤培养基中,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35℃培养18~24小时,接种白色念珠菌的新鲜培 养物至改良马丁培养基中,20~25℃培养24~48小时,上述培养物 用0.9%氯化钠溶液制成含菌数小于100 CFU/mL的菌悬液;接种黑曲 霉的新鲜培养物至沙氏琼脂培养基上,23~28 ℃培养5~7天,加 入3~5 mL无菌的含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液, 将孢子洗脱。然后,用灭菌的纱布将孢子悬液滤至无菌试管内,用 无菌的0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成含孢子数 小于100 CFU/mL的孢子悬液。
培养基
培养基无菌性检 查
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2015版与2010版药典无菌检查法对比
改变项目 培养基灵敏度检查 2015版 2010版
菌液制备:金葡、枯草、 金葡、枯草、铜绿接NB, 铜绿接TSB扩增,白念 白念接改良马丁培养基、 接沙氏葡萄糖液体培养 黑曲霉接改良马丁琼脂 基,黑曲霉用沙氏葡萄 斜面 糖琼脂斜面 培养基接种:FT接种金 葡、铜绿、生孢;TSB 接种枯草、白念、黑曲 霉 FT接种金葡、铜绿、生 孢、枯草;改良马丁接 种白念和黑曲霉
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无菌检查法(2010版)
• 所用到的培养基: 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基 • 培养基的适用性检查: 无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基应符合无菌性检查 和培养基灵敏度检查要求。本检查可在供试品无菌检查前或与供试品无 菌检查同时进行。 • 培养基无菌性检查: 每批培养基随机抽取不少于10支(瓶),5支(瓶)置30~35℃,另5支 (瓶)置20~25℃培养14天,均应无菌生长。 • 灵敏度检查: • 菌种:金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉。
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无菌检查法(2010版)
接种量:系指每个最小包装的最小取样量(mL或g),接种供试品 量按下表进行。
规格 液体制剂(mL)V≤1 1<V≤5 5<V<20 20≤V<50 V≥50 原液或半成品 固体制剂 M<50mg 300mg≤M<5g 50mg≤M<300mg 每支(瓶)供试品的最小接种量 全量 半量 2mL 10mL 半量 半量 全量 半量 150mg
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无菌检查法(2010版)
无菌检查法(2010版)
• 结果判定:空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好, 判该培养基灵敏度检查符合规定。 • 供试品的无菌检查 • 抽验数量:系指一次实验所用最小包装容器的数量(支或瓶)。成 品每亚批均应进行无菌检查。抽检量按下表:
供试品 注 射 剂 批产量(N) N≤100 100<N≤500 N>500 最少抽检数量 5个 10个 20个
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