微卫星分子标记开发方法

微卫星分子标记开发操作指南

1、250ng DNA酶切（DNA必须比较纯）

反应体系：ddH20 17.25µL

10X buffer R 2.5µL

MseⅠ(10U/ µL ) 0.25uL（ 2.5U）

DNA(50ng/µL) 5µL

总反应体系25µL, PCR仪内37℃ ,3h酶切,65℃，15分钟失活。电泳检测：

1.5%的琼脂糖，150V 电泳20min，点样量约9µL-10µL，剩余的15µL用于连接。

2、酶切后的产物连接。

反应体系： ddH20 8.8µL

MseⅠ接头1uM (3µL) 即1pmol/µL

0.405nmol/μl = 405 pmol/μl

T4 buffer 3µL

T4 DNA ligase(5U/ µL) 0.2µL(1u)

酶切后DNA 15 µL

总反应体系30µL, PCR仪内37℃ ,2h或21℃，过夜连接，65℃10min失活。

MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/ 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’

O=100µL 10pmol/µL

接头：10µL 100pmol/µL+90µLddH

2

3、连接的产物用灭菌蒸馏水稀释10倍（10µL酶切产物+90µL水）

4、稀释的连接产物预扩增。

反应体系：无菌水 9.6µL

Taq DNA聚合酶 buffer 1 X 2µL

MgCl2 1.5mM 2µL

MseⅠ-N primer 120ng 1µL

dNT Ps 200uM 0.2µL

Taq DNA聚合酶0.4U 0.2µL

稀释的连接产物 5 µL 5µL

总反应体系20µL。

反应条件为： 94℃ 30s， 53℃ 60s，72℃ 60s，14-26个循环（循环数需优化

14-17-20-23-26）

MseⅠ-N 引物为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA N-3’，N表示包括所有4种可能的选择碱基N=A，T，C，G,1.5%琼脂糖电泳检测

5、最佳反应条件下，PCR重新扩增一次，获得几百ng的扩增产物，试剂盒纯化。

6、杂交 * 5’端生物素化的探针的选择：常见的几种探针：（AC）15，（CT）15，

（GA）15，（CAA）10，（AAG）8，（GATA）7，（ACCT）6

*250 ng -500 ng扩增的DNA与50-80 pmol 的生物素化的探针混合，加入总体积100 µL的SSC X4.2和SDS 0.07%中（即21µL SSC X10

加0.7 µL SDS 10%，加水至100 µL）。2 µg的DNA与200pmol 的

探针在终体积500µL终浓度0.5 X SSC 溶液中，60℃杂交2小时。

* 95℃ 3min变性，室温，15min退火

7、富集

纯化的带接头的DNA（2-2.5微克）约30-50µL，95℃变性5分钟，与3’端生物

素化的（CA）

10或（GA）

10

或5’生物素化探针（60℃杂交2h）200pmol（1µL）

在50℃ 0.5倍SSC杂交1.5h,加入600µL的磁珠重悬于100µL的0.5 X SSC 溶液中，室温，20分钟。

300µL的预热至50℃的0.1 X SSC 溶液洗2次

300µL的0.1 X SSC 溶液室温洗2次

DNA洗脱至100µL的预热至50℃的双蒸水中，2次

试剂盒操作说明：

轻弹管底，使磁珠重悬，用磁场吸附磁珠,小心去上清（不能离心!!）

用300µL的0.5 X SSC 溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清(重复2次)

重悬于100µL的0.5 X SSC,加入DNA探针混合物

室温温育10分钟，每1-2分钟，倒置管子混匀

吸附磁珠，去上清

300µL的0.1 X SSC 溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清。重复3次，最后一次去上清尽量去干净（洗完后的上清保留以便查找实验故障的原因）

重悬于100µL的水中，轻弹管底是磁珠重悬

磁场吸附磁珠，上清液（我们需要的产物）转移至灭菌的管子中，保留磁珠。加

入150µL的水，重复洗脱一遍，共得到250µL的产物

富集

（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH * 1mg 的磁珠用TEN

100

中。

7.5）冲洗，重悬于40 µL的TEN

100

* 加入10 µL（约1 u g）的不相关的PCR产物（为了尽量减少非特异性结合的DNA）

* DNA-探针混合物用300 µL的TEN

稀释

100

* 稀释的DNA-探针混合物加入洗好的磁珠，室温温育30min，温育过程中不时温和搅拌(Incubate on rotator, or sideways in orbital

shaker on slow speed at 50 for 30 min.)

* 15000转，离心1min，（以便查找失败原因）

（（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, *非严格冲洗：加入400µL的TEN

1000

1M NaCl, pH 7.5）, 室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，

上清转移至另一管中保存备用。重复2次。

*严格冲洗：加入400µL的SSC 0.2 X，0.1% SDS，室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复

2次。

8、加入50 µL TE （10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0），95℃温育5min，

上清（里面包含我们需要的DNA）迅速转移并保存。

9、磁珠中再加入12µL的0.15 M的NaOH，加入适量的0.1167 M的醋酸（醋酸

量事先用滴定法标定），最后加入TE 至总体积50 µL，95℃温育5min，保存。

10、所得DNA 加入10%体积的3M的乙酸钠，混匀。再加入1体积的-20℃预冷的

异丙醇，室温过夜沉淀或-20℃沉淀30分钟，再用50 µL 灭菌蒸馏水溶解。

0.8%的琼脂糖电泳检测，DNA点样量2µL，123bp Marker 3µL ,140v ，30分

钟。理想的为弥散，否则考虑重做。

11、9、10所得的DNA分别PCR 扩增：

反应体系：Taq DNA聚合酶 buffer 1 X

MgCl2 1.5mM