生物显微技术复习概要

第二章显微镜及其附加设备

第一节显微镜的光学原理

放大镜

放大镜的放大率公式，通常采用以下形式：

Γ=250/ f ′

由上式可知，放大镜的放大率仅由其焦距所决定，焦距越小则放大率越大。由于单透镜有相差存在，加上加工的原因，不能期望以减少凸透镜的焦距来获得很大的放大率。简单放大镜放大率都在10×以下。构造相对复杂的为解剖显微镜，它由几个透镜组成，其放大率在200×以下。

放大镜的放大倍数越高，其焦距越短，工作距离也越短。

凸透镜的成像规律为：

若u>2f，则2f>v>f，异侧倒立缩小的实像

若2f>u>f，则v>2f，异侧倒立放大的实像

若u=f，则v→∞，不成相

若u

分辨率

分辨率是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。

普通光学显微镜分辨率的极限是0.2μm。可把物体放大1500倍。

放大率

放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。

总放大率=物镜放大率×目镜放大率

显微镜的放大倍数是指对物体长度的放大。

显微镜放大率公式：Γ=250Δ/ f1 f2

式中：Δ为光学筒长，一般为160mm； 250为明视距离，单位为mm； f 1为物镜的焦距；f 2为目镜的焦距。

在考虑其总放大倍率的同时，首先应选取所用物镜的放大倍数，其次才考虑目镜的放大倍数。其原因在于显微镜的成像质量主要取决于物镜的分辨率。

镜口角

孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。

数值孔径

数值孔径（NA）：是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率和孔径角半数的正玄之乘积。用公式表示如下：NA=hsinu/2 。

它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。

数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。

●降低波长λ值，使用短波长光源。

●增大介质n值和提高NA值。

●增大孔径角。

●增加明暗反差。

焦深

焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。

焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。焦深大，分辨率降低。

镜像亮度

镜像亮度是指显微镜观察中的图像明暗程度。

NA值越大，镜像的亮度就越大，总放大倍数就越好。

视场亮度

视场亮度是显微镜所观察的整个视场（或视野）的明暗程度。

它与物镜、目镜、聚光镜、视场光阑、光源等因素有关。

视场亮度大，镜像亮度大。

视场直径

视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。

视场直径23最为科学，大视场容易引起场曲。F=FN/M; F: 视场直径，FN：视场数，M:物镜放大率。视场数（Field Number, 简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出：1．视场直径与视场数成正比。

2．增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。

覆盖度

覆盖度：显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。

国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm, 许可范围在0.16-0.18mm.,

工作距离

工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。

平时习惯所说的调焦？

机械筒长

从镜筒的肩部（目镜下缘）到物镜螺旋肩部之间的长度叫机械筒长，一般它的长度为160mm。

焦点：决定图像是模糊还是清晰？焦点与焦距有关，且可以通过聚焦旋钮控制。样本载玻片上的盖片厚度也会影响图像对焦。正确的盖片厚度应标注在物镜的侧面。

分辨率：图像中的两个像素达到多近的间距时会分辨不清？分辨率与物镜的数值孔径（数值孔径越大，分辨率越高）以及通过透镜的光线波长（波长越短，分辨率越好）有关。

调节不同参数产生的效果

●亮度：表示图像有多明亮？亮度与照明系统相关，因而可以通过改变灯的电压/电阻器，

以及调节聚光器和光圈/针孔孔径进行更改。此外，亮度还与物镜的数值孔径有关（数值孔径越大，图像越明亮）。

●对比度：样本周围区域的光照差别怎样？对比度与照明系统相关，可以通过改变光线

强度以及光圈/针孔孔径对其进行调节。除此之外，对样本进行化学着色也可以增强对比度。

明视距离

从眼球的水晶体到放大的虚像之间的距离叫明视距离，它的长度为250mm，这是观察显微镜中物像最适宜的距离。

一、物镜

●物镜分前透镜和后透镜。

●高倍镜为弹簧物镜。

（一）几个概念

1、齐焦反映某一倍数的物镜观察图像清晰后，在转换至另一倍率的物镜时，其成像亦应基本清晰，且物镜光路也基本合轴，中心不偏离。

2、色差

3、球差

4、场曲

2、透镜的像差

某一物点发出的光束，经过透镜以后，仍然是同心光束，还都会聚在一点，由这种方式形成的像点称为理想像点。由理想像点构成与原物形状、颜色完全相似的像，称为理想像。实际上，从一点发出的光束在通过透镜后并不完全会聚于一点，而是分布在空间一个很小的区域内，成为一个模糊的斑点或称弥散圈。同样，一个物体通过透镜后也不可能形成一个与原物体完全相似的像。造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差。

像差

●单色相差

●轴上点的单色像差――球差慧差

像散

●轴外点的单色像差―场曲

畸变

●复色像差――－－－－色差

1）轴上点的单色像差――球差

●由光轴上一点发出的光线经透镜折射后，不再是同心光束，入射光线的孔径角不同，

其出射光线与光轴交点的位置就不同，相对于理想像点有不同的偏离，这就是球差。

孔径角越大，则光线的折射率越大。

球差及球差的消除

球差

●球差也称球面差、球面像差，指透过透镜边缘的光线曲折度大于透过中央部分的现象，

会聚的焦点参差不齐，使成像不清晰，有时变形。