08_疫苗制造基本程序

在纯化区域的多个小屋子里，我多次穿过一些特 殊的筛子、管道，并被放在高速离心机中旋转了很久， 我逐渐被浓缩，而那些灭活剂和鸡蛋中的杂质等就被 陆续去除掉了。期间工作人员还往我身边加入了一种 叫做裂解剂的特殊物质，使我由一个完整的病毒分开 成碎片，我身上的核酸和一些可能会引起人体不良反 应的大分子蛋白以及裂解剂经进一步的纯化被去除， 主要保留了能引起人体免疫反应的表面抗原有效成分 和部分的内部抗原蛋白。在除菌过滤过后，我就有了 一个新的身份：病毒原液。接下来我被按照一定的比 例用注射用水进行稀释，并加入适量的盐分，形成了 疫苗半成品
（一）鸡胚选择
受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以 免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。 从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和 湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接 毒培养。
一、病毒性禽胚培养疫苗制造
鸡胚选择
种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗
三、病毒性动物组织疫苗制造
动物选择 种毒与接种 观察与收 获 配苗
（三）观察与收获
动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因 不同病毒而异。常规观察、检查的项目如食欲、精神和活动状态、体温、 粪便、尿和血液变化等。 根据观察的征象和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖 杀，采取收集含毒量高的器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液 制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊 的羊脑组织制造。
我的今生：与家族决裂
要制备大量的流感疫苗，首先必须繁殖大量的流感病 毒。经过近百年的探索，科学家发现我非常适合在鸡胚的 尿囊腔中繁殖。 接种机将非常少量的我准确地注入鸡胚的尿囊腔中，然 后一车车的鸡胚被放入无菌、恒温的孵化间，我就悄悄地 在里头快速繁殖着……三天过后，我已经繁殖出很多很多 的病毒了。 此后，大量的我被合并在一起并转移到灭活间，一种 特殊的灭活剂被加入到容器中，在不断搅拌的过程中我慢 慢失去了知觉，沉沉睡去……大约一周过后，我从噩梦中 惊醒，却赫然发现自己已经完全失去了活性，无法使人致 病也无法繁殖和生长了！
分装
动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗
病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病 毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗 称为组织疫苗(tissue vaccine)。 动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者 多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以 弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。
（一）动物选择
动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力 有着决定性的作用，动物必须符合下列标准： (1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性 病原体动物； (2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面 合乎要求的实验动物。
三、病毒性动物组织疫苗制造
流 程 图 3 病 毒 性 细 胞 疫 苗 制 造 工 艺 流 程
动物或胚胎
毒 株
培育 鉴定 种 毒 扩增 鉴定 种 子 原 料 配制 保护剂
组 织
剪碎 消化 细胞悬液 生长细胞 培养 收获 灭活
原 料 配制
——
细胞培养液
传代细胞 原 料 配制 灭菌 佐剂
原 苗
配 苗
灭活病毒
配 苗
（混匀、乳化）
分装、冻干 检验 活疫苗
一、病毒性禽胚培养疫苗制造
鸡胚选择
（四）配 苗
按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进 行配苗。 1.湿苗 通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素500~1000U，放臵 0~10C 冷暗处处理后分装。 2.冻干苗 经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加 入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素 500~1000U，混合后分装冻干。 3.灭活苗 收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液， 按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫 苗，放臵4-10C保存。
一、病毒性禽胚培养疫苗制造
鸡胚选择
种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （三）接毒与收获 1.接毒
鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫 苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。 接种途径：绒毛尿囊膜接种 11~12日龄胚 尿囊腔接种
羊膜腔接种
卵黄囊接种
9~11日龄胚 10~12日龄胚 5~8日龄胚
如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3 稀释毒种 0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊 膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。
2.培养收获
鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标 准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。 如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相对湿度 60%~70%条件培养增殖，收集接毒后24~48h内死亡胚， 臵0~10C冷却4~24h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿 苗用。 也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻 干苗。 鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48~120h内死亡的 鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。
我的前世：飘荡千年 我的前世，是一个已经在地球上飘荡了千万年的小小病毒。 我是一个直径只有８０－１２０纳米的小小病毒，但是我的祖 先经过不断地变异和重组，繁衍成了一个庞大的家族，分成很 多的亚型。 ２００９年３月开始，我逐渐出现在人类的视野中。科学 家们开始将我命名为猪流感，后来又更名为新甲型Ｈ１Ｎ１流 感。科学家们把我分离出来后，与一个没有致病性的流感病毒 株ＰＲ８放在一起进行繁殖。在这个过程中，我与ＰＲ８不断 地重组，科学家从这些重组株中筛选出了一株具有ＰＲ８主体 骨架，但同时又有Ｈ１和Ｎ１抗原特性的新毒株。安全性评估 结果表明，重组后的我毒性已大大降低，适合用于疫苗的生产。 于是我从此与家族决裂，并走上了一条对抗流感病毒之路。
不过我要变成可以供人类直接使用的疫苗还要经 过非常严格的分装和包装程序。由于我比较脆弱， 需要在２℃－８℃的温度下避光保存。接下来的 两三周时间里，我还要经过两道考核关：生产厂 家和中国药品生物制品检定所会随机抽取一部分 已经完成全部包装的我再进行严格的体检。通过 企业自检和国家复检后，中国药品生物制品检定 所才会给每一批疫苗颁发一个合格证书，也就是 说只有这个时候我才真正获得了我的合法“户 口”，马上就可以投入到抗击流感的战斗中去 啦。
动物选择 种毒与接种 观察与收 获 配苗
（二）种毒与接种
种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增 殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和 免疫原性检查合格后使用。 接种途径依病毒性质和目的而异，例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注 射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗， 用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。 几种动物常用的接种途径如下： 1. 脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。 2. 静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。 3. 肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。 4. 皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。 5. 腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。
检验 灭活疫苗
示例——甲型H1N1流感疫苗
• 数据来源：北京科兴生物制品有限公司研制
情况报告
全病毒
裂解病毒
亚单位 （表面抗原）
减毒活病毒
不同疫苗中流感病毒的形态
一支甲型Ｈ１Ｎ１流感疫苗自述—— 前世：致病流感病毒 今生：抗击甲流斗士
我是一支甲型Ｈ１Ｎ１流感疫苗。从我开始“孕 育”到“出生”再到拿到合法“户口”大概需要４ ５天的时间，中间要经过各项严格的考验，才能为 人类的安全保驾护航———如果把一支甲型Ｈ１Ｎ １流感疫苗想像成一个新生儿，上述这段话就是它 的诞生记。８日上午，记者在位于北京市海淀区的 北京科兴生物制品有限公司的厂房内，全程观摩了 甲型Ｈ１Ｎ１流感疫苗的生产过程。
二、病毒性细胞培养疫苗制造
种毒与毒种继代 （四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时 或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小 病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎 细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现 70%-85%以上细胞病变时即可收获。 细胞制备 接毒与收获 配苗
二、病毒性细胞培养疫苗制造
种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗
细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以 强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序 既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细 胞及细胞培养方法也有所不同
（一）种毒与毒种继代
用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无 菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门 检定分发。 领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种， 制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种， 或为冻干毒种。
二、病毒性细胞培养疫苗制造
种毒与毒种继代 （三）细胞制备 细胞制备 接毒与收获 配苗
培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的 生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有 5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。 不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。 目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和 悬浮培养在我国尚处于试验之中。
病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养 瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取； 或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌 检验、毒价测定合格后供配苗用。