木瓜蛋白酶的固定化

•游离木瓜蛋白酶 活力的测定 •固定化木瓜蛋白 酶的制备 •固定化酶活力测 定 •固定化酶制备条 件的优化
实验设计 实验步骤 实验结果
•固定化酶性质研 究 最佳制备条件为微孔淀粉浓度4％，海藻酸钠浓度3％，
条件优化： •不同浓度的微孔淀 粉对酶活力的影响 •不同浓度的海藻酸 钠对酶活力的影响 •不同浓度的GaG1溶 液对固定化木瓜蛋 白酶活力的影响 •固定化木瓜蛋白酶 制备条件的正交试 验
结果总结
实验结果分析
实验步骤
实验原理 取螯合载体，加入木瓜蛋白酶室温下 采用反相悬浮包埋法制备，利用原子吸收分 振荡4h，用PBS洗涤数次至上清中检测不到 光光度法测定上清Gu2+ 浓度，计算载体吸 酶活，即得固定化的木瓜蛋白酶 附Gu2+的量。
实验结果分析
1、载体吸附Gu2+ 的量对固定化酶的影响: 当Gu2+载体﹤1.5×10-2mol/g 时，酶 活随给Gu2+量的增加而增加，这是因为 琼脂糖IDA只有在结合了Gu2+后才能以 配位作用固定酶，随给Gu2+量的增加载 体表面固定木瓜蛋白酶的位点增多，导 致载酶量增加而引起酶活上升；当Gu2+ 载体﹥ 1.5×10-2mol/g时，载体表面 的IDA 逐渐被Gu2+饱和至过饱和，载体 的载酶量达到最大值，但被琼脂糖IDA 载体过量吸附的Gu2+在随后的酶反应过 程中溢出至溶液中抑制了木瓜蛋白酶的 活性，使得酶活随Gu2+量的增加而减少。
•载体吸附---共价结合法
原理：酶蛋白上非活性必需基团（氨基酸残基）与载体通过共价键形成 不可逆的联结。
载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺衍生物 优点：结合牢固，酶不易脱落，稳定性好。 缺点：载体需活化，操作复杂，反应条件剧烈
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载体
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•载体吸附---离子结合法
原理：酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固体载体由于离子效应， 将酶固定在离子交换基团的非水溶性载体上。 常见载体为： DEAE纤维素（二乙氨基已基纤维素）、 TEAE纤维素（三 乙基氨基乙基纤维素）、DEAE葡聚糖凝胶 特点：操作简便，酶分子结构及活性中心不变
通过物理或化学 法将酶束缚在一 定的空间，使酶 只能在此区间进 行催化反应，反 应结束后，能迅 速与底物和产物 分开，实现重复 使用。
食品酶学 研究生课件
•固定化酶的特点
易与反应液分开
可反复使用，降低成本
酶的稳定性提高
优点
较易控制终止酶反应的进程
产物纯化简便
食品酶学 研究生课件
•固定化酶的特点
酶活力有损失
食品酶学 研究生课件
•共价结合吸附固定木瓜蛋白酶
在使用金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶时， 固定化反应条件温和，对酶的高级结构 影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显 提高；载体的载酶量大；载体的再生、酶的固定 化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利 用 1.载体的制备 2.酶的固定化 3.酶活的测定 4.载 体吸附Gu2+ 的量对固定化酶的影响 5.固定化时间 的影响 6.pH 对固定化酶的影响 7.给酶量对固定 化酶的影响 8.固定化酶的性质 利用金属螯合配体与蛋白质相 结合的原理，选用磁性琼脂糖亚氨基二乙酸（IDA）-Gu2+ 做 为金属螯合载体，定向固定木 瓜蛋白酶。
2、不同浓度的海藻酸钠对酶活力的影响：
随着海藻酸钠浓度的增加，包埋木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续 加大海藻酸钠浓度就会使表面密度不断加大，底物运动扩散更加困难， 降低酶活。木瓜蛋白酶固定化的最适海藻酸钠浓度为3％。
实验结果：
3、不同浓度的GaG12溶液对固定化木瓜蛋白酶活力的影响
当CaC12 浓度为5．5％时酶活最高。一般情况下凝胶强度与钙离子浓 度成正比，但由于有微孔淀粉的存在使钙离子对木瓜蛋白酶的抑制作 用发生变化，但总体上酶活是先升高后降低的。
CaC12浓度5.5％。固定化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7， 最适温度72℃。
实验结果：
1、不同浓度的微孔淀粉对酶活力的影响：
木瓜蛋白酶固定化的最适微孔淀粉浓度为4％。随着微孔淀粉浓度的 增加，吸附木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大微孔淀粉浓 度．就会使底物运动扩散更加困难，降低酶活。
实验结果：
•载体吸附---物理吸附法 活性碳 E
吸附
惰性载体 （不溶于水）
硅胶
石英 硅藻土
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特点：操作简单，吸附力弱；pH 、T、 底物浓度变 化时，会导致酶从载体上部分或全部脱落。
•交联法
原理：依靠双功能基团试剂，使酶蛋白分子间发生交联，凝集成网 状结构，从而成为不溶性酶。
特点：反应条件剧烈、酶活力低、颗粒较细，一般不能单独使用， 常常和包埋法、吸附法等联合使用。
实验结果分析
2.固定化时间的影响 3.pH 对固定化酶的影响
载体的载酶量随固定化时间的延长而增加， 载体的载酶量随PH 值的增大而增加，pH7 4h达到最大值并趋于稳定。 时饱和。
实验结果分析
4.给酶量对固定化酶的影响
给酶量为10mg/g 载体时，酶的固定 化率最高，随着给酶量的增大，载体 上金属螯合配体结合位点逐渐饱和， 固定化率逐渐降低，与此相反，所得 的固定化酶的活力逐渐增加。根据以 上结果，在固定化酶的制备实验中， 每次给酶量为30mg/g 载体，这样就 能以较低的给酶量得到较高活力的固 定化酶和较高的固定化率。
参考文献
1、沈 斌，魏荣卿，欧阳平凯等；胺化聚苯乙烯载体柔性固定化木瓜蛋白酶 [J];化 工 学 报;2005.06,56(6):1070-1075. 2、金 锋;微孑L淀粉一海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的研究[J];中国酿造 ;2009,208(7):83-85. 3、刘琳琳，曾力希，刘婷，邓乐;金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究 [J];生物工程学报;2005.09,21(5):789-793. 4、程凡亮,陈伶利,王卫等；氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究[J];生物 工程学报;2004.03,20(2):287-289. 5、王宪政;固定化木瓜蛋白酶研究进展[J];山东化工;2009,38:31-39. 6、徐元，何琦;木瓜蛋白酶的固定化及其在啤酒澄清中应用的研究[J];天然产 物分离;2003,1(3):6-12.
常用凝胶为：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、 角叉菜胶
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•包埋法---微胶囊型
原理：以半透性的有机高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴，在有机溶剂 中，含酶水溶液的液滴界面处，发生界面凝集作用，形成半透性膜，使 酶被包裹于其中，阻止了酶的漏失。 微囊直径一般为m-几百m的小珠
特点：小分子底物能通过膜与酶接触，产物也可释放出来。
常用双功能基团为：戊二醛 -CHO-(CH2)3-CHO
食品酶学 研究生课件
•举例：木瓜蛋白酶的固定
固定方法
一、微孔淀粉 ——海藻酸钠 固定化木瓜蛋 白酶
（包埋法固定）
二、金属螯合 载体定向固定 化木瓜蛋白酶
（载体吸附—— 共价结合）
食品酶学 研究生课件
一种新型的变性淀粉，具有较大的比孔容和 包埋法固定木瓜蛋白酶 比表面积，可以吸附很多种功能性物质 凝胶剂 采用微孔淀粉——海藻酸钠包埋法固定 木瓜蛋白酶，探讨固定化条件、固定化 木瓜蛋白酶及游离酶的酶学性质。
胞内酶必须经过酶的分离 手续
增加了生产的成本， 工厂初始投资大
缺点
与完整菌体相比不适于多酶反应
只能用于可溶性底物
食品酶学 研究生课件
•酶固定化的方法
格子型
•包埋法
微胶囊型
•交联法
共价结合法
•载体结合法
离子结合法 分离的酶
一定方式 载体 固定
物理吸附法
食品酶学 研究生课件
•包埋法---格子型
原理：将酶包埋在聚合物的凝胶格子中
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱLOGO
——木瓜蛋白酶的固定
万丽花
2011.11.4
食品酶学 研究生课件
主要内容
1
固定化酶的介绍 固定化酶的特点 酶固定化的方法
2
3 4
举例：木瓜蛋白酶的固定及性质研究
食品酶学 研究生课件
•固定化酶的介绍
固定化酶 原因1 酶对热、酸、碱 等有机溶剂均不 稳定，即使在酶 反应的最适环境 中，也易失活。 原因2 酶一般以溶于水的 状态作用于底物， 因此，当反应结束 时，一般难以回收 ，也难以从产物中 除尽，又由于酶仅 能使用一次，因此 ，使得产物纯度不 够，且造成很大的 浪费。
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