免疫分析技术和相关仪器

◈
⊃
►
◄
■
4、管式固相酶免疫测定仪
1990年德国推出的全自动管式ELISA分析 系统和配套试剂 用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素 结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的 抗体和显色底物ABTS 测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只 需一点定标 测定的精密度CV在3%左右
◈ ⊃
◈
⊃
►
◄
■
优势
自动化程度高：
前后处理一体化设计，减少人与样品的 接触机会，降低感染。各种自动安全检 测能。
稳
定：
只要避免人为操作错误， 可连续数年良好工作。
准
◈
确：
⊃
►
不存在交叉感染。反应振荡， 确保检测 准确。
◄
■
优势
高 速：
加注、读板速度快
扩 展 性：
软件可升级，样本量增加，可联机使用
-HRP-Luminol系统 -AP-AMPPD系统 -黄嘌呤氧化酶系统 无须原位进样、 以速率法测量。
◈ ⊃
:
► ◄
■
闪光与辉光及其测量方式的差别
闪光尖峰 发光信号
积分法测量
辉光坪区
速率法测量
原位进样 ◈ ⊃
►
◄
■
时间
光生物学检测技术的优越性-1
消除放射性危害
无半衰期限制，试剂稳定性、 有效期延长
发光样品 产生光子
光电倍增管 高 压 高速分频器 高速比较器 高速放大器
相对发光单位 数字脉冲(RLU) ◈ ⊃
脉冲信号
►
◄
■
单光子计数式发光检测仪
单光子计数器 计数/贮存器
打 印 机
程控高压 样品运动/定位装置 原位注射泵 控制器 计 算 机
程控自动门锁及检测装置
发光仪执行模块 ◈ ⊃
发光仪控制模块
反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁 铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后 反应液呈粉红色。
返回节目录
◈
⊃
►
◄
■
三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
（一）评价指标和方法 1．滤光片波长精度检查及其峰值测定 2．灵敏度和准确度 3．通道差与孔间差检测 4．零点飘移 5．精密度评价 6．线性测定 7．双波长评价
(一)全自动化学发光免疫分析系统 采用化学发光技术和磁性微粒子分离 技术相结合的免疫分析系统
◈
⊃
►
◄
■
1．仪器测定原理
该类分析技术有两种方法：
-竞争法 测定小分子抗原物质 -夹心法 测定大分子抗原物质
◈
⊃
►
◄
■
2．仪器组成
-化学发光免疫分析 -微粒子化学发光免疫分析 -电化学发光免疫分析 -化学发光酶免疫分析 -生物发光免疫分析 临床以前三者较为常用
◈ ⊃
►
◄
■
发光免疫分析的种类和基本原理
（一）基本种类
1．化学发光免疫分析 2．微粒子化学发光免疫分析 3．电化学发光免疫分析 4．生物发光免疫分析 5．化学发光酶免疫分析
◈ ⊃
►
◄
■
需要了解的基本概念
双抗体夹心法
◈
⊃
►
◄
■
需要了解的基本概念
我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备 称为酶标仪。 一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的 功能，还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作 步骤繁琐。 全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、 孵育、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能 于一体。
►
◄
■
化学发光 （Chemiluminescence）
由于化学反应（通常是氧化）产生电子能级处于 激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子 ，从而导致的发光现象。
生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于 发光体温度升高所至，发射波长也与其温度无关
◈
⊃
►
◄
■
化学发光的分类-1
酶促化学发光：
反应30-60分钟 洗涤去除未结合的反应物
反应0-5分钟 发光底物 仪器检测
◈
⊃
►
◄
■
流动池检测方式示意图
冲洗液 干燥空气 检测器 负压泵
四通阀 计量泵
检测池
废液
氧化剂
样品管
原位进样泵
◈
⊃
►
◄
■
AUTOLIA-12/48型全自动发光免疫分析仪
◈
⊃
►
◄
■
二、发光免疫分析仪的种类、 工作原理和基本结构
辣根过氧化物酶系统
碱性磷酸酶系统
黄嘌呤氧化酶系统
非酶促化学发光：
吖啶酯系统
草酸酯系统 三价铁-鲁米诺系统
◈ ⊃
►
◄
■
化学发光的分类-2
按发光持续时间
闪光（Flash）
发光时间在数秒内，如吖啶酯 以原位进样(In Situ Injector) 和时间积分法测量
辉光（Glow）
发光时间在数十分钟以上，如： :
► ◄
◈
⊃
■
6、磁微粒固相酶免疫测定仪
瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板 和试剂组成： 试剂包括：

抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体 特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm） FITC结合的特异抗体或抗原 碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原 底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯
实现连续、动态、重复测定
► ◄
◈
⊃
■
光生物学检测技术的优越性-2
适合于复合标记系统多指标测定
操作简单，反应快，易实现自动化 灵敏度和线性范围超过以往技术
◈
⊃
►
◄
■
发光免疫技术分类
根据示踪物检测的不同而分为： -荧光免疫测定 -电化学发光免疫测定 -化学发光免疫---再根据标记物的不同分：
►
◄
■
发光免疫分析基本操作步骤（一步法）
待测样品 标记抗体或抗原
包被抗体或抗原的反应管 反应30-60分钟 洗涤去除未结合的反应物
反应0-5分钟 发光底物 仪器检测
◈
⊃
►
◄
■
发光免疫分析基本操作步骤（二步法）
待测样品 包被抗体或抗原的反应管 反应30-60分钟 标记抗体或抗原
洗涤去除未结合的反应物
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为: 酶扩大免疫测定
非均相(或异相)酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法
均相酶免疫测定
固相酶免疫法
enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） (酶联免疫吸附测定
◈
⊃
►
◄
■
需要了解的基本概念
酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA) 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要 用于药物测定 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物 的分离才能测定. 分离的方法主要通过固相载体， 故此法称为固相酶免疫测定ELISA 。 ELISA的测定模式 : 1 双抗体夹心法 2 间 接 法 3 竞 争 法
►
◄
■
4根独立 上下吸 移管
◈
⊃
►
◄
■
检 测
光 纤
◈
⊃
►
◄
■
反应板
反应板 夹具
◈
⊃
►
◄
■
清
洗 装 置
◈
⊃
►
◄
■
供水箱
废水箱
◈
⊃
►
◄
■
检测时间: 以乙肝两对半（立可读）为例
◈
⊃
►
◄
■
检测时间: 仪器操作各单元如下（满板）
加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面 传感器） 加酶时间： 4’46’’(洗5遍，不浸泡) 加两种显色剂A、B共： 5’30’’ 加终止液： 2’42’’ 读板时间： 2’58’’
◈
⊃
►
◄
线性范围
■
待测物浓度（ X ）
竞争法特点
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：
S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值
功能灵敏度： （变异）≤20%的最低可检测浓度 线性范围：

功能灵敏度-变异≤20%的最高检测浓度 ≥0.99的曲线范围
◈ ⊃
相关系数
►
◄
■
间接法原理
标记抗体 （二抗） 待测抗体 包被抗原
包被体
◈
⊃
►
◄
■
俘获法原理
标记抗原 待测抗体 俘获抗体 （二抗） 包被体
◈
⊃
►
◄
■
双抗原夹心法原理
标记抗原 待测抗体 包被抗原 包被体
◈
⊃
►
◄
■
间接包被夹心法原理
标记抗体 待测抗原 俘获抗体 包被连接物
包被体
特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺
◈ ⊃
返回节目录
◈
⊃
►
◄
■
二、酶免疫分析仪的类型、 工作原理及基本结构
微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等
◈ ⊃
►
◄
■
(一)微孔板固相酶免疫测定仪器
线性范围：
功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度
相关系数
≥0.99的曲线范围
◈
⊃
►
◄
■
竞争法的原理
待测物
标记抗原 包被抗体
◈
⊃
►
◄
固相支持物表面
■
竞争法的剂量--反应关系曲线
信号强度（ Y ）
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度： 测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度 线性范围： （分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度 相关系数≥0.99的曲线范围
►
◄
■
双抗体夹心法（三明治法）原理
待测物 标记抗体
包被抗体
◈
⊃
►
◄
固相支持物表面
■
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
Hook(前滞)效应
◈
⊃
►
◄
线性范围
■
待测物浓度（X）
夹心法特点
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：
S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。
功能灵敏度：
测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度。
◈
⊃
►
◄
■
（二）基本测定方法
根据发光反应检测方式的不同可分为

反应在液相中进行，经 离心或分离措施后，再进行测定发光强度
将抗原抗体复合物结合 在固相载体(如聚苯乙烯管)或分离介质上(如 磁性微粒球等)，再进行测定发光强度 同均相酶免，不需要经过 离心或分离步骤，即可直接进行发光强度检 测◈ ⊃ ► ◄ ■
1、酶标仪
有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于：
比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度
◈
⊃
►
◄
■
◈
⊃
►
◄
■
◈
⊃
►
◄
■
2半自动微孔板式ELISA分析仪 在酶标仪的基础上再配置:
加液器 温育器 洗板机 测读仪分别组成 测定中需由手工将微孔板移至下一步骤 的仪器中进行。
◈
⊃
►
◄
■
3全自动微孔板式ELISA分析仪
自动化酶免疫分析系统由:
加样系统 温育系统 洗板系统 判读系统 机械臂系统 液路动力系统 软件控制系统等组成
◈ ⊃
►
◄
■
计算机部分 与 检测装置部分
◈
⊃
►
◄
■
温育箱
反应板 迭式存储 器
◈
⊃
►
◄
■
X-Y头架
◈
⊃
►
◄
■
样品架
50根装
50×3
◈
⊃
◈ ⊃
►
◄
■
（二）酶免疫分析仪的维护
重点是光学部分
1．滤光片波长精度检查 2．通道差与孔间差检测
返回节目录
◈
⊃
►
◄
■
四、酶免疫分析仪的临床应用
１．病原体及其抗体的检测 2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3．肿瘤标志物 4．多种激素 5．药物和毒品
返回节目录
返回总目录
◈
⊃
►
◄
■
第二节 发光免疫分析仪
集经典方法学和先进技术于一体， 既将发光反应与免疫反应相结合的免疫 分析方法
采用微量倍增技术，敏感性度，特异性 好，所用试剂安全、稳定； 检测范围广泛，从传统的蛋白、激素、 酶乃至药物均可检测 发展非常迅速，各种相应仪器不断出现， 自动化程度也越来越高。
◈ ⊃
用户做主更多：
开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 ►无限存档 ◄ ■
◈
⊃
3全自动微孔板式ELISA分析仪
全自动ELISA仪器本身的精密度一般在3% 左右。 应用优质试剂测定结果的精密度，定量测 定可达到7%以下； 常用的定性测定为感染性疾病抗原、抗体 的检测，精密度在10%左右。
►
◄
■
5、微粒固相酶免疫测定仪
美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微 粒（颗粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体 或抗原包被在微粒上。 第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制 的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤 维膜上，液体则通过膜滤出。 以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物 为4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。
1．液相法
2．固相法


3．均相法
发光信号检测
光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD） 原理
光信号 光电转换器件 电压或电流信号 放大
主要特点 结构简单、性能稳定 但灵敏度低、线性范围较窄。
◈
⊃
►
◄
■
单光子计数器工作原理
在各打拿极之间得到 能量和数目的倍增
激发光阴极 产生光电子
在阳极上形 成较强信号
第十六章
免疫分பைடு நூலகம்技术和相关仪器
内
容
提
要
酶免疫分析仪
发光免疫分析仪 放射免疫分仪析仪 免疫浊度分析仪 时间分辨荧光免疫分析仪
◈ ⊃
►
◄
■
第
酶免疫分析仪
一
节
一、技术的分类 二、分析仪的类型、工作原理及基本结构 三、性能评价和维护保养 四、临床应用
返回总目录
◈
⊃
►
◄
■
一、酶免疫分析技术的分类：
酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)