链霉菌基因转移的方法

5生物工程进展62002,Vol.22,No.1
技术与方法
链霉菌基因转移的方法
吴胜夏焕章
(沈阳药科大学生物制药系,沈阳110016)
摘要本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法,涉及原生质体转化、电穿孔、接合转移和噬菌体转导,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。

关键词链霉菌原生质体转化电穿孔接合转移噬菌体转导
链霉菌是一类重要的工业微生物,它可以产生各种各样的生物活性物质,越来越受到重视,链霉菌基因工程技术的发展,使得克隆次级代谢产物生物合成基因、有目的地定向改造基因、提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物成为可能。

在对一个链霉菌进行基因改造时,首要的问题就是建立所研究菌株的基因转移系统,这是实现对其基因功能分析、生物合成基因簇定位、基因改造等一系列工作的基础。

然而,有许多链霉菌,尤其是有实用价值的链霉菌在进行DNA转化时,均遇到很大困难。

为克服这一困难,科研人员进行许多研究。

通过分离内源性质粒、筛选噬菌体并通过改造其结构而构建了许多有用的克隆载体。

在方法学上也进行了许多有益的探索,建立了几种基因转移方法如转化、转导和接合转移等。

下面对这些方法在链霉菌中应用逐一进行介绍。

1转化
包括PE G-介导的质粒转化原生质体(polyeth-ylene glycol-induced plasmid transformation of proto-plasts)和电穿孔(electroporation)。

前者是链霉菌基因操作中最常用的方法,后者主要用于植物和动物细胞,在链霉菌中也有成功的报道。

1.1PEG-介导的质粒转化原生质体
转化大肠杆菌的关键是用冷刺激和CaCl2处理诱导感受态细胞,由此形成通过质粒中介的克隆操作,但这在链霉菌中尚无成功的报道。

在Okanishi 和他的合作者有关链霉菌原生质体形成、再生和转染工作的基础上,Bibb等发现当有PEG存在时,质粒DNA能以很高的频率转化变铅青链霉菌原生质体[1]。

通过对影响转化过程的各个参数的优化以及对转化方法的改进,这一方法已成功地应用于许多种链霉菌[2-4]。

到目前为止该方法仍然是链霉菌转化和转染的基础。

影响原生质体转化的主要因素有原生质体的制备和再生的条件、转化时所用原生质体的数目、质粒的来源和浓度、再生平板的干燥程度、PE G的来源和浓度、抗生素选择时间等。

在进行转化实验之前,首先要制备原生质体,要求原生质体有较高的形成率和再生率。

据文献报道不同链霉菌原生质体形成和再生的条件不完全相同,需要根据不同菌种的性质加以改进。

另外,链霉菌对外源DNA普遍存在限制修饰作用,这也是影响转化成败的一个关键性因素。

除少数链霉菌如变铅青链霉菌(S.lividans)和生二素链霉菌(S.ambo faciens)等对外源DNA无限制修饰作用外,其它的链霉菌都表现出程度不同的限制修饰作用。

如除虫链霉菌(S.avermitilis)中存在一种独特的甲基化专一性的限制修饰系统[5];S.lipma-nii表达两种限制修饰系统[6];而弗氏链霉菌(S.fra-diae)中存在五种限制修饰系统等[7]。

链霉菌对外源DNA的限制修饰作用可由以下几个因素中的一个或几个共同决定:质粒的不相容性、DNase活力、限制性内切酶。

1.1.1质粒的不相容性
质粒的不相容性主要由两个方面的因素引起的:¹由于复制控制而产生的不相容性。

复制控制系统不能将它们作为两个质粒来识别,因而只能随机选择进行复制;º由于分离引起的不相容性。

如果两个质粒具有相同的par功能,这两个质粒有可能是不亲和的。

当共存的质粒具有相同的par功能时,在细胞分裂时只有一种能够被分配到子细胞。

然而,有时一个子细胞只能得到一种类型的质粒,而另一个细胞得到另外一种类型的质粒,这样得到的子细胞都是丢失一种质粒的细胞。

在极端的情况
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下,一个质粒的存在完全阻止另一个质粒的复制,因而无法建立异源的质粒系统。

在链霉菌中已发现许多内源性质粒,有线状和环状之分,大小也相差很悬殊,小的有几千个碱基对,大的有几十万个碱基对。

从变铅青链霉菌中分离到的内源性质粒pIJ101是一个8.9kb的高拷贝质粒,由它衍生出的一系列质粒已成为链霉菌基因工程中应用最广泛的克隆载体。

但一些pIJ101的衍生质粒之间存在强的不相容性,无法在同一宿主中共存[8]。

有文献报道,某些链霉菌中的内源性质粒可以和一些质粒载体共存,如pKC1139可与生米卡链霉菌中的内源性质粒pSMY1共存[9];pIJ101系列的质粒可与球孢链霉菌中的内源性质粒pSGL1共存等[10]。

1.1.2DNase活力
DNase能降解线状和环状DNA,强的DNase活力影响质粒的转化和分离[11]。

有关DNase在链霉菌限制修饰系统中的作用研究最多的是抗生链霉菌(S.antibioticus)和淡青链霉菌(S.glaucescens)[12,13]。

这两个链霉菌的无细胞提取液中都没有检测到II 型限制性内切酶活力,非特异的DNase在宿主对外源DNA的降解方面起主要作用。

抗生链霉菌胞外DNase主要定位于细胞壁和细胞膜之间,与此相类似,淡青链霉菌胞外DNase主要定位于细胞外膜。

DNase的合成受营养条件的限制,此外,Mg2+是维持其活性所必须的金属元素。

DNase对热比较敏感,用/热处理0可以部分灭活。

11113限制性内切酶
已经在不同的链霉菌中发现超过33种II型限制性内切酶,但是否存在I型和III型限制性内切酶还未见报道。

来自链霉菌的一些II型限制性内切酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中获得表达[14-17]。

这些限制性内切酶多数识别6个碱基,但也有识别8个碱基的如Sse8387I[16]。

表达限制性内切酶的宿主普遍对外源DNA具有较强的限制性。

通过识别外源DNA上特定的碱基序列,并从中切开,最终导致外源DNA被降解,致使转化或转染无法进行。

而细胞中同时存在的修饰酶(多为甲基化酶)则可将自身染色体上相同序列加以修饰而避免被降解。

限制修饰系统在链霉菌中广泛存在,这给链霉菌的基因操作带来很多困难。

对于如何克服链霉菌原生质体对外源DNA的限制修饰作用,科研人员也进行了许多有益的探索。

覃重军等人报道,来自标准宿主变铅青链霉菌TK24的质粒pIJ702无法转入吸水链霉菌应城变种10-22(S.hygrosco picus subsp.yingchen-gensis10-22)中,但来自弗氏链霉菌ATCC10745的pIJ702,却可以低频转化10-22原生质体。

原因可能是弗氏链霉菌ATCC10745和吸水链霉菌应城变种10-22之间存在相同修饰DNA的机制,因而通过弗氏链霉菌对pIJ702的修饰间接克服了吸水链霉菌对pIJ702的限制性障碍[18]。

朱春宝等在研究天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubidus)的转化系统时发现pIJ702无法直接转化天蓝淡红链霉菌的野生株SI-PI1482,但却可以很低的频率转化该菌的阻断变株N-18。

用从转化子中分离到质粒DNA再转化野生株SI PI1482,也获得成功[19]。

作者认为原因是诱变使表达限制酶的基因受到损伤而影响了限制酶的表达。

因此,通过异源宿主的修饰机制或采用突变株为中介宿主可能是克服质粒转化限制性障碍的有效措施。

另外下面将要提到到电穿孔、接合转移以及转导也能在一定程度上绕开宿主的限制性障碍。

112电穿孔
利用高压脉冲电流将DNA导入细胞的方法称为电穿孔法,也称为电激法。

通过对细胞悬液和DNA的混合物施以瞬时高压脉冲电流,导致细胞膜上出现短暂的通道,外源DNA通过这些通道进入细胞。

该法在DNA转化动物细胞和植物原生质体中得到了广泛的应用。

在链霉菌中的应用实例比较少[20-25],涉及到的链霉菌有变铅青链霉菌(S.livi-dans)、龟裂链霉菌(S.rimosus)、小小链霉菌(S.par-vulus)、酒红链霉菌(S.vinaceus)、委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)、弗吉尼亚链霉菌(S.virginiae)、除虫链霉菌(S.avermitilis)和头状轮生链霉菌(Stre ptover-ticillium caes pitosus)等。

电击的对象有原生质体、经溶菌酶处理的菌丝、未经溶菌酶处理的菌丝体以及预萌发的孢子等。

影响电穿孔的一些因素有电脉冲的强度和时间、电击前菌丝体的预处理、电击时缓冲液的组成等。

但这些方法并不通用或者仅限于某种特定的链霉菌,如用于小小链霉菌和酒红链霉菌的电穿孔程序对变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌就不适用。

与PEG-介导的原生质体转化方法相比,电穿孔的程序相对简单、方便、快捷,是一种很有潜力的基因转移方法,但如何在链霉菌获得更为广泛而成功的应用,需要进一步的探索。

2接合转移
研究人员很早就发现了质粒转移现象,但普遍认为质粒通过接合转移仅限于种属密切相关的细菌之间。

Tei w u-C uot等人突破了这一观念的束缚,他
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们在体外构建了一种穿梭质粒,并通过接合转移成功地将此质粒从革兰氏阴性细菌大肠杆菌中转入到许多革兰氏阳性细菌中[26]。

随后科研人员进行了许多试验,并在种属关系相差很远的物种之间通过接合的方法实现了质粒的转移[27-29]。

在链霉菌中已发现许多具有自我转移性的质粒(sel-f transmissible plasmid),如pIJ101、SCP2*、SCP1、SLP1、SLP2、SLP3、pSAM2[30]、pSN22[31]、pSA1.1[32]等,这些质粒有共同的诊断性特征,即当质粒进入某个没有质粒的受体时,气生菌丝的发育受到过滤性抑制,这种现象叫做/麻点形成0,表型命名为Ltz+,也称为致死接合反应。

/麻点形成0这种肉眼可见的表观现象已被用于检测链霉菌中是否存在可转移性质粒、分离消除质粒的菌株、进行链霉菌种间的接合转移等方面。

赵书春等人通过这种方法甚至将大型线状质粒pHZ1000(230kb)和pHZ1001(90kb)从链霉菌T8-4中转入到异源宿主)))变铅青链霉菌ZX1中[33]。

通过对接合转移系统的研究,已从这些可转移质粒中分离到与接合转移有关的基因。

负责接合转移的基因可分为两类,一类是tra,负责质粒在链霉菌菌丝体之间的转移,其表达在转录水平上受到korA (traR)基因表达产物的调控[31];另一类是spd,表达产物为小分子的水溶性蛋白,麻点的形成需要spd 基因的活化,灭活spd基因则显著降低麻点的大小。

如质粒pSG5,它是一个可转移质粒,但不形成麻点,原因是pSG5中的spd基因无转录活性[34]。

以上从链霉菌中分离到的质粒转移仅限于同种或不同种的链霉菌之间。

Mazodoer等人于1989年报道了通过接合转移的方法把质粒DNA从大肠杆菌转移到变铅青链霉菌中,实现了质粒在大肠杆菌和链霉菌之间的跨属转移[28]。

他们将来自IncP质粒RK2的ori T功能片段插入到含有大肠杆菌质粒pBR322和链霉菌质粒pIJ101复制起点的双功能质粒上。

该质粒在携有一个整合型质粒RP4(提供反式作用的转移功能)的大肠杆菌S17-1中发生转移。

在104个预萌发的孢子中就有一个是接受了质粒的转移接合子。

之后,科研人员将接合转移的方法成功地用于其它一些链霉菌中,如弗氏链霉菌、生二素链霉菌、丰加链霉菌(S.toyocaensis)和许多其它的链霉菌中。

这种跨属的质粒转移方法为某些难以用常规方法进行DNA转化的链霉菌和其它放线菌属的遗传操作提供了重要手段,如Saccharopolys pora s pinosa对外源DNA表现出很强的限制性,PEG介导的质粒转化原生质体以及噬菌体感染都不能将外源DNA导入细胞内。

但通过接合转移方法突破了宿主的限制性障碍,成功地将质粒从大肠杆菌转移到Saccharo polys pora s pinosa中[35]。

现已构建了许多用于这种转移目的的质粒载体如pP M801、pPM803、pKC1139、pKC1218等等,这些质粒携带有来自RK2的ori T功能区而缺少tra基因,因此这些质粒的转移还需要RP4(IncP)协助。

常规的做法是将这类穿梭质粒转移到含有RP4因子的大肠杆菌如E T12567或S17-1中,再用这些携带有质粒和RP4的大肠杆菌和链霉菌进行杂交,这样在RP4的推动下,穿梭质粒就从大肠杆菌转移到目的链霉菌中。

与电穿孔一样,接合转移是一种很有潜力的基因转移方法,尽管有一些对外源DNA有很强限制性的链霉菌如牲畜链霉菌(S.cattleya)、弗吉尼亚链霉菌(S.virginiae)、吸水链霉菌的某些菌株(S.hygrosco picus. ATCC29253)等无法通过接合的方法将质粒从大肠杆菌引入到细胞内(注:这些链霉菌用PEG-介导的质粒转化原生质体以及电穿孔的方法也无法实现转化),但接合转移可以避开胞外核酸酶,使DNA免遭核酸酶的降解[36],因此在某种程度上可以克服宿主对外源DNA的限制性障碍。

3噬菌体转导
链霉菌噬菌体在土壤中广泛存在,可分为两类,一类是通过对连环体DNA的位点特异性切割把DNA包装到噬菌体头部;另一类是从连环体的pac 位点进行满头式包装。

U C31是研究最多的第一类噬菌体,而U SF1则是第二类的代表。

除U C31和U SF1之外,已报道的用于链霉菌转导的噬菌体还有SV1、U A6、U9、A9、R4、FP4、FP22、FP43、FP46、FP50、VP11等。

U SF1和SV1可进行普遍性转导,不过宿主范围只分别局限于弗氏链霉菌和委内瑞拉链霉菌。

温和性噬菌体U C31的宿主范围较广,可侵染137个供试菌种的一半。

由U C31衍生的噬菌体载体如KC401、KC505、KC508、KC504、KC515、KC516等在链霉菌基因克隆和分析方面的应用最为成功。

除U C31之外,另一个极具开发潜力的噬菌体是从灰褐链霉菌(S.griseo fuscus)中分离到的噬菌体FP43,它的宿主范围很广。

McHenney等将噬菌体FP43中7.8kb的高频转导hft(high-frequency transduction)片段插入到链霉菌高拷贝质粒pIJ702的SphI位点,构建了一个转导性质粒pRHB101,该质粒可在70%参加测试的链霉菌中进行高频转导[37]。

它不仅可以转导对外源DNA无限制性的链霉菌(如S.ambo fa-
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ciens、S.lividans、S.parvulus、S.griseo f uscus),也可以转导已被确认具有限制性系统的链霉菌(如S.albus [SalPI]、S.phaeochromogenes[SphI]、S.tubercidicus [StuI]等)。

虽然pRHB101上有一个PstI(SalPI)的识别位点,但仍可以转导S.albus(SalPI),只是这些转导子的裂解液中含有少量的转导颗粒,进一步证明转导子中pRHB101上PstI位点已被修饰。

野生型的弗氏链霉菌表达五种或更多的限制性系统,对外源DNA表现出很强的限制性,常规的PEG-介导的原生质体转化,效率很低。

但通过变动转导前细胞的生长条件,pRHB101可在这个具有极强限制性的菌中较容易实现高频转导[37]。

当然也有一些具有限制系统的链霉菌,pRHB101无法转导,如pRHB101无法转导S.albus G,该菌产生限制性内切酶SalI,后者在pRHB101有多个切点。

噬菌体FP43不产生粘性末端,是通过满头式机制(headful mechanism)包装DNA。

被克隆的FP43片段(hft)可以介导质粒pRHB101的高频转导,在转导颗粒中质粒DNA以线状连环体(liner concate mer)的形式存在,这表明hft区可能促进滚环复制以及参与质粒DNA头部包装。

功能分析进一步证明hft区包含有pac位点(也称为packaging origin),它使质粒pRHB101以线状连环体形式包装到噬菌体头部。

满头式包装和hft片段上pac位点的存在是质粒pRHB101高效转导的原因。

而hft区介导的质粒pRHB101转导可以相对有效地绕过某些限制性系统,部分原因是由于被转导DNA的连环体性质所致[38]。

另一方面与hft片段上缺乏大部分链霉菌限制性内切酶或同裂酶的识别位点有关[39]。

因此,这一转导系统提供了把基因克隆到pR HB101衍生载体上,转化到FP43原始宿主灰褐链霉菌(S.griseo-fuscus)中,然后再把质粒转导到许多其它宿主中去的可能性。

4结语
应当说,PEG-介导的质粒转化原生质体为链霉菌和相关放线菌的基因克隆提供了基础,这些程序提供了一种方法去克隆和分析包括抗生素生物合成基因在内的许多链霉菌基因,因此迄今为止仍是进行链霉菌和其它放线菌基因转移的主要方法。

质粒载体和噬菌体载体系统的发展,为人们克隆或改造感兴趣的基因提供了更多的可供选择的手段。

就方法学而言,接合转移和转导较为快捷和方便,原生质体转化因涉及到原生质体的制备和再生相对耗时且工作环节多;但就应用范围而言,原生质体转化应用范围更广,可被用于鸟枪克隆和阻断变株随机互补实验,这在快速筛选目的基因方面有其它两种方法所无法比拟的优势,而接合转移和转导在单基因操作方面更加方便。

链霉菌是一个高度分化的菌属,不同菌种之间有很大的差异,适用于一种链霉菌的转化方法不一定适用于其它链霉菌,即使同一种链霉菌的不同菌株由于遗传背景的不同,转化效率也差别很大,况且并不是每一种链霉菌都能够进行转化或转染,应根据所研究的菌种探索最适的转化方法。

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The Current State in Research of Chemically inducible Expression System of Plant Genetic Engineering
Tang Sun-yong Niu Heng-yao Zhang Liming Sun Yong-ru Li Wen-bin
(Institute of Genetics Chi nese Academy of Sciences,Beijing100101)
Abstract Under the control of an inducible system,a transgene can be expressed at a given developmental stage for a specific duration of interest.This flexibility is much beneficial for us to study the function of a given gene.This revie w will focus on several chemically inducible systems,which are consisted of regulatory elements deriving from organisms that are distant from plants in evolution,and their applications in plant genetic engineering.
Key words chemically inducible system,effetor,reporter,plant genetic engineering.
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The methods of gene transfer in Streptomyces
Wu Sheng Xia Huangzhang
(Department of Bi opharmaceutics,Shengyang Pharmaceutical Uni versity,Shengyang,110016)
Abstract This article mainly summarizes the methods of gene transfer in Streptom yces,including transformation of protoplasts,electroporation,conjugation and phage transduction.The various factors which influence gene transfer in Strep-tomyces are also discussed.
Key words Streptomyces,transformation of protoplasts,electroporation,c onjugation,transduction
83。