气孔运动观测实验

气孔运动观测实验
一、材料选择：
10片叶的拟南芥（移栽以后11-13d左右，大概是3周大小的苗子）
二、叶子的选择;
选择次新一轮的叶片，要求大小，状态一致。

如果叶片上有褶皱等不健康的状态均不进行选择。

三、所需准备的物品：
2.0离心管，冷光源，牙签，镊子，显微镜
四、具体操作步骤：
1、选取整齐一致的拟南芥植株，选取同一轮叶片中大小，状态一致的叶片，带叶柄剪下。

2、叶片背面朝上，放入表皮条缓冲液中（2.0离心管），浸入缓冲液液面以下。

每个管中一片叶子，且不同管中叶片的液下深度要求一致。

3、将不同的株系均匀置于冷光源下，照射2-3h。

4、撕取叶片中脉一侧的下表皮进行观测，看气孔是否已经完全打开。

一般2.5-4之间算是完全打开，最好是3-4。

5、若气孔已经完全打开，则加入ABA进行处理2-3h。

6、撕取叶片中脉另一侧的下表皮进行观测，一般野生型的气孔关闭到1.0以下才算是处理成功，否则需要提高ABA浓度。

注意：
1、适合气孔观察的拟南芥只有几天，叶片太老或太嫩都不合适，且容易撕下叶肉。

一般有叶肉撕下的部分气孔开度都不够精准。

2、一般一个表皮条只观测最中间的部分，四周的不精确，叶柄部位的气孔也不在统计范围之内。

3、操作时间太长会增加误差，所以对于熟练的人来说，一次最多只观察5个样本。

4、一个样本一般观察2-3个视野，每个视野先大概浏览一下是否整齐，然后记录下气孔开度。

视野中所有气孔开度都记录下来。

5、显微镜一般使用40倍镜，比较精确。

6、因为叶片厚度不均，所以应该不停的调焦，以保证正在观测的气孔达到最清楚的状态。

每个人的标准不同，所以应该由一个人完成，以避免人为误差。

7、因为植物气孔的运动也存在一定的节律，所以经验性的操作时间是早上9：00开始取叶片11：30-12：00 ABA 处理比较合适，避免在中午的时候操作。

（针对早上6：00开灯的16/8h光照情况）
8、当不知道植株表型时可以先用10μM-25μM ABA处理，2-2.5
h 后气孔关闭为1 时即可。

9、ABA 用无水乙醇配置成100mM 母液，工作液为1mM，用水稀释即可。

平时存于-20 ℃。