噬菌体裂解酶作为抗菌剂的潜在价值

噬菌体裂解酶作为抗菌剂的潜在价值

袁玉玉1，丛聪1，王丽丽1,2,4，李晓宇1,2,4，李淑英2,3,4，徐永平1,2,3,4,*

(1 大连理工大学生物工程学院, 辽宁大连 116024；

2 动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心，辽宁大连 116600；

3 大连赛姆生物工程技术公司, 辽宁大连 116620;

4 辽宁省大连赛姆噬菌体应用工程技术研究中心，辽宁大连 116600)

摘要：多耐药病原细菌的不断出现和传播给公共医疗造成了严峻的威胁和挑战，开发新的抗菌药物迫在眉睫。噬菌体裂解酶是噬菌体在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶。噬菌体裂解酶来源于噬菌体，具有独特的进化选择优势，不仅能高效迅速杀灭多重耐药细菌，且不易引起细菌产生新的耐药性。本文对噬菌体裂解酶的结构和功能进行了简要的介绍，重点综述了裂解酶作用机制与应用前景。

关键词：噬菌体；裂解酶；抗菌剂；应用

中图分类号：R978.1+9 文献标志码：A 文章编号：1001-8751(2019)05-0420-05

Potential Value of Bacteriophage Endolysins as Antibacterial Agent

Yuan Yu-yu 1, Cong Cong 1, Wang Li-li 1,2,4, Xiao Yu-Li 1,2,4, Li Shu-ying 2,3,4, Xu Yong-ping 1,2,3,4

(1 School of Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024; 2 Center for Food Safety of Animal Origin, Ministry of Education, Dalian 116600; 3 Dalian SEM Bio-Engineering Technology Co. Ltd, Dalian 116620;

4 Center for Phage Applied Engineering Technology of Dalian SEM, Liaoning Province, Dalian 116600)

Abstract ：The emergence and rapid spread of multidrug resistant has induced intense research for novel therapeutic approaches. Bacteriophages (phages) and their endolysins (lysins) have long been recognized for their ability to combat multidrug resistant pathogens. Bacteriophages are the most abundant viruses on the earth that can specifically infect and lyse their host bacteria. Endolysins are phage encoded enzymes that degrade the bacterial cell wall at the end of phage replication cycle. Endolysins have antibacterial activity against gram-positive bacteria. In the last decade, endolysins have been investigated as therapeutic agents and applied to a wide range of bacteria. In our review, the structures and functions of endolysins were outlined, and the recent research progress in endolysin therapy of bacterial infections was summarized.

Keywords ：bacteriophage; endolysins; antibacterial agent; application;

收稿日期：2019-07-01

基金项目：国家海洋公益项目(201405003-3)。

作者简介：袁玉玉，博士在读，主要研究方向为动物细菌性感染噬菌体疗法。*通信作者：徐永平，教授，博士，主要研究方向为动物生物技术与营养。

抗菌药物耐药性(Antimicrobial drug resistance ，AMR)是全世界日益增长的挑战。新的抗性机制的出现及其通过纵向和横向基因转移的广泛分布令人震惊。因此，多重耐药(MDR)细菌正在全球传播，且MDR 细菌感染的全面影响仍然未知。噬菌体疗法作为一项开拓性的医学创新，在其基础科学尚未

得到初步了解之前就已经开始实施。因此，使用噬菌体作为治疗药物产生了许多问题，尤其是由于对噬菌体生物学缺乏深刻的理解。特别是，与任何抗菌药物治疗一样，关键是使用一些具有一定潜力的制剂，首先在体外，然后在体内，作为靶向微生物的有效拮抗剂，并在其应用中是安全的。噬菌体裂

解酶是噬菌体感染宿主晚期表达的一类肽聚糖水解酶。噬菌体裂解酶作为治疗制剂具有以下特点：(1)具有高度保守的种属特异性，不会伤害机体细胞，也不干扰正常的菌群；(2)具有高效、快速的杀菌机制，可在短时间内裂解细菌；(3)不易产生抗性。裂解酶是一种蛋白质分子，不易刺激细菌产生抗性。近年来建立的多种动物感染模型，初步体现了裂解酶用于耐药细菌感染治疗的潜力与优势。本文将噬菌体裂解酶的结构和功能进行了简要的介绍，重点综述了裂解酶作用机制与应用前景。

1 裂解酶结构与作用机制

针对革兰阳性菌和革兰阴性菌的裂解酶结构通常是有差异的，这反映了细菌群体之间的细胞壁结构差异。来自革兰阳性菌的裂解酶已经发展到利用模块化设计，其中催化活性和底物识别被分别称为细胞壁结合结构域(cell wall binding domains，CBD)和酶促活性结构域(enzymatically active domains，EAD)的两种不同类型的功能结构域[1,2,3]。EAD赋予酶的催化机制(即，裂解细菌肽聚糖内的特异性键)，但有一些裂解酶的CBD能将蛋白质靶向其底物，并在细胞裂解后保持其紧密结合到细胞壁碎片，从而阻止扩散，以及破坏周围尚未被噬菌体感染的完整细胞[4]。相比之下，革兰阴性菌的外膜(outer membrane，OM)可以通过限制裂解酶从外部进入肽聚糖层来防止这类附带损害，这可能解释了为什么来自感染革兰阴性宿主的噬菌体的裂解酶主要是小的单域球状蛋白(分子量在15到20 kDa之间)，通常没有特定的CBD模块[5]。与革兰阳性菌的裂解酶相比，这类裂解酶可能会更好地发挥酶的催化作用(辅助细胞裂解过程中的多个催化反应)，这类酶结合到一个位点会具有非常低的释放率[6]。但也有例外情况，据报道，来自假单胞菌噬菌体(KZ144和EL188)的两种革兰阴性菌的裂解酶具有N末端CBD 和C末端EAD的模块化结构。N端部分的KZ144以高亲和力与铜绿假单胞菌细胞壁结合并识别其他革兰阴性细菌的PG [7]。另一方面，金黄色阳性的裂解酶主要具有相反的功能模块取向，其中EAD位于N 端，CBD在C端[8-10]。

2 裂解酶的安全性

从安全角度来看，裂解酶的高度特异性是其最有益的特性之一。特别是在食品安全和医疗应用中，这些酶特异性地破坏目标病原体而不影响共生菌群，这一事实使得它们比许多常用的抗生素或化学防腐剂更有优势。关于人或动物体裂解酶的全身施用，主要关注的是释放与细菌裂解有关的促炎细胞碎片如磷壁酸、脂磷壁酸和肽聚糖，这可能潜在地导致严重的并发症，例如感染性休克和多器官衰竭[11]。Entenza等发现通过连续静脉输注Cpl-1治疗的小鼠中促炎性细胞因子浓度增加[12]。而Witzenrath及其同事报道，相同酶在12h内间隔施用时，细胞因子浓度比未处理动物低[13]。这两个研究之间的差异可能是由于高浓度持续暴露于Cpl-1使细菌细胞壁碎裂增强，导致促炎性分子水平升高[14]。最后，由于它们的蛋白质性质，裂解酶是无腐蚀性和生物可降解的[15]。

3 裂解酶在医药方面的应用

细菌可以定殖和感染人体任何部位。因此，裂解酶能够到达感染部位是重要的。注射裂解酶已成为主要的施用途径进行应用及研究。目前，有几种类型的注射已被证明其在动物模型中的功效：静脉内[16-18]、玻璃体内[19]，腹膜内[20-22]和脑池内[23]。而且，SAL200和CF-301目前都在临床上II期临床试验(表1)注射[24]。注射主要是为了评估在动物模型中治疗全身性感染如脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎和菌血症。P128是一种具有抗葡萄球菌活性的嵌合型酶，并已配制成水凝胶[25]。水凝胶由羟乙基纤维素、丙二醇和甘油组成。Abouhmad等[26]将T4裂解酶与纤维素融合模块用于将裂解酶固定在纤维素纱布材料上，通常用于伤口敷料。融合蛋白保留了其抗革兰阳性菌的活性，同时不可逆地将裂解酶束缚于敷料

表1 生产裂解酶的公司及临床研究

公司应用领域主要裂解酶作用菌种临床试验认证号Contrafect医疗保健CF-301金葡菌菌血症Starting Phase II NCT03163446 Gangagen医疗保健P128鼻腔中的金葡球菌Finished Phase IIa NCT01746654 Intron Biotechnology医疗保健SAL200葡萄球菌感染Starting Phase IIa NCT03089697

Micreos 化妆品和

医疗保健

Gladskin葡萄球菌感染Starting combined Phase I and II NCT02840955

Lysando伤口感染Medolysin®细菌伤口感染(Pre)clinical N.A.