(完整版)核酸的理化性质.doc
核酸的组成与理化性质
NH2
OH
N
N
N
N
N
N
NN HOCH2 O
HH
H2N N N HOCH2 O
HH
H
H
H
H
OH OH
OH OH
腺嘌呤核苷 鸟嘌呤核苷
HO N HOCH2 O
HH
HO N HOCH2 O
HH
H
H
H
H
OH OH
OH OH
胞嘧啶核苷
尿嘧啶核苷
3、核苷酸的解离
O
O
pK1=0.7~1.6
R O P OH
R O P O-
酯键
酯键
NH2
N
N
O
5'
N
9 N
HO P O CH2 O-
O
1'
HH
H 2'
H
糖苷键
OH OH
腺苷酸
（二）碱水解
HOH 2C
O
base
-
RNA
OH
水解
H
H
H
H
O
O
P
O
OH
环磷酸酯
2′-核苷酸 3′-核苷酸
混合物
RNA
RNA的磷酸酯键易被碱水解→2’-或3’-核苷酸 DNA对稀碱稳定,因为没有2’-OH；
或40 μ g/ml单链DNA（或RNA） 或20 μ g/ml寡核苷酸
220 260
300
/nm
3 判断DNA是否变性：
核酸溶液的紫外吸收可以用摩尔磷吸光系数 (p)来表示， 测定核酸的 (p)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。
(p): 摩尔磷吸光系数
核酸的理化性质
第三节核酸的理化性质1一、核酸的分子大小一核酸的分子大小二、核酸的溶解度与粘度微溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙醇来沉淀DNA ；DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1-2 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。
2三、核酸的酸碱性质核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。
p对DNA来说，碱基对在pH4.0～11.0最稳定。
3四、核酸的紫外吸收4OD260的应用1.判断核酸样品的纯度–DNA纯品: OD 260/OD 280= 1.8纯–RNA纯品: OD260/OD 280= 2.0–含杂蛋白及苯酚，降低 2. DNA或RNA的定量对于纯样相当于对于纯样品，OD 260=1.0相当于•50μg/ml双链DNA•40μg/ml单链DNA（或RNA）•20μg/ml寡核苷酸5核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
摩尔吸光系数30.98Aε）＝ε：摩尔吸光系数A：吸收值P WL（）W：每升溶液磷重量L：比色杯内径63.判断DNA是否变性核酸在变性时，紫外吸收增加的现象称为增色效应；在一定条件下，变性核酸可以复性，紫外吸收又恢复到原来水平，这一现象称为减原来水平这现象称为减色效应。
7五、核酸的变性、复性和杂交五核酸的变性复性和杂交（一）变性P260定义：核酸受到加热、极端的pH或离子强度的定义核酸受到加热极端的H降低等因素或特殊的化学试剂作用，其双螺旋区的氢键断裂变成单链的过程。
8变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失9DNA的紫外吸收光谱¾增色效应：当核酸变性时260nm处光吸收值显著增加的现象。
10¾热变性：DNA的稀盐溶液加热到80~100℃，热变性的稀盐溶液热℃几分钟后双螺旋结构被破坏，氢键断裂，两条链彼此分开形成无规则线团的现象。
11¾解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。
核酸的理化性质与应用
六、核酸杂交
沉降速度快。
三、高分子特性
核酸是生物大分子，具有大分子的一般特性。溶 液中的核酸分子在引力场中可以下沉。不同构象的核 酸（线形、开环、超螺旋结构）、蛋白质及其他杂质 在超速离心机的强大引力场中，沉降的速度有很大差 异，所以可以用超速离心法纯化核酸。
四、核酸变性
核酸在某些条件下会发生氢键断裂，双螺旋结 构松散分开即为核酸的变性，但无共价键的断裂。 粘度改变，钢性线性分子变得无序，粘度下降。UV
核酸的理化性质与应用
核酸的理化性质与应用
主要内容 重要概念：
核酸的酸碱性 核酸的紫外吸收 核酸的高分子性质 核酸的变性、复性和杂交
一、核酸的酸碱性
核酸既含磷酸基又含碱基，为两性电解质，它们 在不同的pH溶液中解离程度不同，在一定条件下可形 成兼性离子。
二、紫外吸收特性
➢ 核酸在260nm处有吸收峰，可用于定量分析。 ➢ 核酸还具有高分子化合物的某些性质，如粘度大，
吸收增强，其规律如下：
OD260（254）
100%
③
50%
②ห้องสมุดไป่ตู้
①
80 Tm 90 100 ℃
变性温度范围
五、核酸的复性
DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐 渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键， 恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。
六、核酸杂交
当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些 核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对， 出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链， 称核酸分子杂交。
核酸的性质
核酸的性质核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。
一、一般物理性质1. 溶解度DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。
它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。
2. 分子大小DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。
核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。
3. 形状及粘度核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。
RNA溶液的粘度要小得多。
核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。
二、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。
DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。
在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。
不同核苷酸有不同的吸收特性。
所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。
实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。
对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。
第三节 核酸的理化性质
牛脾磷酸 二酯酶
Fig. 4-30 Snake venom phosphodiesterase and spleen phosphodiesterase are exonucleases that degrade polynucleotides from opposite ends.
• 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸）
• 变性DNA粘度下降。
4. 溶解性：
• DNA、RNA微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 • 核酸钠盐比游离酸易溶于水。
5. 特殊颜色反应
（1）地衣酚法定性、定量鉴定RNA: D-核糖 + 浓盐酸 + 地衣酚
FeCl3 ）
（2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA:
应用：
（1）定性定量鉴定各种核苷酸 （2）核酸纯度鉴定
纯DNA: A260 / A280 > 1.8 纯RNA: A260 / A280 = 2.0
（3）核酸定量鉴定
A260 =1, 相当于 50g / ml 双螺旋DNA 40g / ml 单链DNA（RNA） 20g / ml 寡核苷酸
（4）核酸变性程度的鉴定
b: DNase Ⅱ，产物为3´- 核苷酸或以其为尾的寡核苷酸
三、核酸的酸碱性质
• 核苷酸含有磷酸基团和碱基，是两性电解质。 在pI处，核苷酸以兼性离子存在。 • DNA和RNA分子也是两性电解质。 多核苷酸中，磷酸基pK1´=1.5，因其酸性较强， 所以核酸表现为酸性。
四、核酸的紫外吸收
嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、
根据作用方式：
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ） 根据底物： 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ） 牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶
生物化学核酸的理化性质
一、粘度大分子溶液比普通溶液粘度大，线形大分子又比球形大分子粘度大。
DNA是线形大分子，人类二倍体DNA总量3.3×109bp，全长可达1.75米，DNA分子平均长度在4cm以上，而双螺旋直径只有2nm，长度与直径之比高达107。
因此，DNA粘度极高，也极易在机械力作用下折断。
双链DNA解链成为单链DNA时，由较伸展的双螺旋变成较紧凑的线团结构，粘度明显下降。
RNA因为分子量小，且呈线团结构，所以其粘度低得多。
二、密度利用密度梯度离心可以测定大分子的浮力密度。
CsCl溶解度大，可制成8M 溶液。
DNA的浮力密度一般在1.7以上，RNA为1.6，蛋白质为1.35-1.40。
分子量相同结构不同的DNA沉降系数不同，线形双螺旋DNA、线形单链DNA、超螺旋DNA沉降系数之比为1:1.14:1.4。
因此通过测定沉降系数可以了解DNA的结构及其变化。
三、紫外吸收嘌呤和嘧啶因其共轭体系而有强紫外吸收。
核酸在260nm有紫外吸收峰，蛋白质在280nm。
利用紫外吸收可测定核酸的浓度和纯度。
一般测定OD260/OD280，DNA=1.8，RNA=2.0。
如果含有蛋白质杂质，比值明显下降。
不纯的核酸不能用紫外吸收法测定浓度。
紫外吸收改变是DNA结构变化的标志，当双链DNA解链时碱基外露增加，紫外吸收明显增加，称为增色效应。
双链、单链DNA与核苷酸的紫外吸收之比是1:1.37:1.6。
四、DNA的变性在一定条件下，双链DNA解链变成单链DNA的现象称为变性或熔化。
加热引起的变性称为热变性；碱性条件（pH>11.3）下，DNA发生碱变性。
此外，尿素、有机溶剂、甚至脱盐都可引起DNA变性。
除去变性因素后，互补的单链DNA 又可以重新结合为双链DNA，称为复性或退火。
DNA复性由局部序列配对形成双链核心的慢速成核反应开始，然后经过快速的所谓拉链反应而完成。
DNA变性后粘度降低，密度和吸光度升高。
变性后的单链DNA与具有同一性序列的DNA链或RNA分子结合形成双链的DNA－DNA或DNA－RNA杂交分子的过程称为杂交或分子杂交。
核酸的重要理化性质
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为 所引起的性质变化没有DNA那样明显。
利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的 情况。
因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收 (260 nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增 加1.1%。
增色效应：变性后DNA对260nm紫外光的吸收 率（A260）比变性前明显增加，这种现象称为 增色效应.
五．核酸的变性、复性与杂交
1. 核酸的变性（denaturation）与变性因素
核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成 单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部 的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的 断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。
能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱 度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变 性。
4、核酸的复性
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链 可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复 性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到 恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件 有关。
将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复 性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性， 这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复 性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的 复性也与它本身的组成和结构有关。
RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种 作用。
三、核酸的水解
1.核酸的酸解和碱解
核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 （降解）。
酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不 同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。
核酸的理化性质
线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
6
二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
7
三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离
核酸的理化性质及其应用
• 退火（annealing）：热变性的DNA经
缓慢冷却后的复性。
• 减色效应：复性后，DNA的OD260又降低
到原来的水平。
• 核酸分子杂交
(hybridization)：
热变性的DNA 在复性过程中，具 有碱基序列部分互 补的不同的DNA之 间或DNA与RNA之 间形成杂化双链的 现象。
分开成单链。
•
变性因素：
加热、过量酸或碱。
• 增色效应：DNA变性使溶液OD260增高。
• 解链温度(Tm)：
DNA的热变性 过程中，紫外光吸 收值达到最大值的 50%时的温度。 Tm值与DNA 分子中的G+C含量 呈正比。
三、DNA的复性与分子杂交
• 复性：变性DNA在适当条件下，两条互补
链又重新恢复天然的双螺旋构象。
第五节
核酸的理化性质及其应用
一、一般理化性质
• பைடு நூலகம்性 • DNA粘度极大，RNA粘度比DNA小
得多
• 在260nm波长有紫外吸收峰，是由
碱基的共轭双键决定的。这一特性常 用作核酸的定性、定量分析。
二、DNA的变性
•
概念：在某些理化因
素作用下，DNA分子互 补碱基对之间的氢键断 裂，使DNA双螺旋结构
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核酸的理化性质
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
核酸的理化性质实验报告
一、实验目的1. 了解核酸的基本理化性质。
2. 掌握核酸的紫外吸收特性、变性、复性和杂交等现象。
3. 学会使用紫外分光光度计、电泳仪等实验仪器。
二、实验原理核酸是一类生物大分子，由核苷酸组成，具有多种理化性质。
本实验主要探讨核酸的紫外吸收特性、变性、复性和杂交等现象。
1. 紫外吸收特性：核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，能够吸收紫外光。
最大吸收峰在260nm附近，可用于核酸的定量分析。
2. 变性：在高温、酸、碱、尿素等理化因素作用下，核酸分子中的双螺旋结构被破坏，双链解开，形成单链。
此过程称为变性。
3. 复性：变性后的核酸在适当条件下，双链可以重新恢复天然的双螺旋结构，此过程称为复性。
4. 杂交：不同来源的核酸变性后，互补碱基序列可以形成杂化双链，此过程称为杂交。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：DNA、RNA、双链DNA、单链DNA、变性DNA、复性DNA、杂交DNA等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电泳仪、恒温水浴锅、移液器、吸管、离心机等。
四、实验方法与步骤1. 紫外吸收特性实验（1）将不同浓度的DNA、RNA溶液分别置于紫外分光光度计的样品池中。
（2）在260nm波长处测定溶液的吸光度值。
（3）根据吸光度值计算核酸浓度。
2. 变性实验（1）将双链DNA溶液置于恒温水浴锅中，分别在不同温度下加热一定时间。
（2）在260nm波长处测定溶液的吸光度值。
（3）分析吸光度值随温度的变化，确定DNA的变性温度。
3. 复性实验（1）将变性DNA溶液置于恒温水浴锅中，在不同温度下加热一定时间。
（2）在260nm波长处测定溶液的吸光度值。
（3）分析吸光度值随温度的变化，确定DNA的复性温度。
4. 杂交实验（1）将不同来源的DNA、RNA溶液混合，置于恒温水浴锅中，在不同温度下加热一定时间。
（2）在260nm波长处测定溶液的吸光度值。
（3）分析吸光度值随温度的变化，确定DNA、RNA的杂交温度。
五、实验结果与分析1. 紫外吸收特性实验实验结果显示，DNA、RNA溶液在260nm波长处的吸光度值随浓度增加而增加，符合朗伯-比尔定律。
(完整版)核酸的理化性质
第15章、核酸的物理化学性质（上册P502）本章重点：1、核酸的水解，2、核酸的紫外吸收，3、核酸的变性和复性本章的主要内容：（一）核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
（1）酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
（2）碱水解：磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过程见P502。
（3）酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为DNase。
剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
（二）核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
（三）核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
（1）可用于测样品纯度（测吸光度A）：A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。
核酸理化性质
3.3 核酸的理化性质、分离纯化和含量测定一核酸的分子大小一核酸的分子大小二核酸的溶解度与黏度•核酸微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂•黏滞度：DNA 〉RNA ；dsDNA〉ssDNA•DNA变性，黏度降低三核酸的酸碱性质•核酸是多元酸，具有较强的酸性;•DNA碱基对在pH4.0~11.0之间最稳定•DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5四核酸的紫外吸收天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm ）光吸收123克原子磷消光系数e(p)•以每升核酸溶液中1克原子磷为标准来计算核酸的消光系数，称为克原子磷消光系数e(p)。
e(p)=A/CL•A：吸收值C：每升溶液中磷的克原子数L：比色杯内径厚度•增色效应hyperchromic effect核酸变性时，紫外吸收值e(p)值显著升高，称为增色效应•减色效应hypochromic effect在一定条件下，变性核酸可以复性，此时紫外吸收值e(p)值又回复至原来水平，称为减色效应五核酸的变性、复性和杂交(一) 变性核酸的变性denaturation维持核酸空间结构的作用力氢键和碱基堆积力被某些理化因素破坏，使核酸的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能的改变。
•增色效应•Tm值•黏度降低•旋光性降低•沉降系数S增加•浮力密度大大增加•对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定程度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。
Tm：熔解温度(melting temperature) DNA的Tm值一般在70-85℃之间。
影响Tm值的因素•1.DNA的均一性均质DNA Tm范围小异质DNA Tm范围大•ii. G-C含量G-C含量与Tm值成正比关系G-C含量越高，Tm值越大•iii. 介质中的离子强度•离子强度较低的介质中，D N A的T m较低，范围较宽•离子强度较高的介质中，情况则相反•D N A制品保存在较高浓度的缓冲液(一般1m o l/L N a C l溶液)。
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第 15 章、核酸的物理化学性质（上册 P502）
本章重点： 1、核酸的水解， 2、核酸的紫外吸收， 3、核酸的变性和复性本
章的主要内容：
（一）核酸的水解：
所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
（1）酸水解：
糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
（2）碱水解：
磷酸酯键易水解， RNA 比 DNA 易水解，因为 RNA 核糖上有 2‘ - OH ，水解过程见
P502。
（3）酶水解：
为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：
按底物专一性分为 RNase（核糖核酸酶）和 DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对
底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用
点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（ EC 2.7.7.16 ），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（ Py）
‘
- 3 - 磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为 DNase。
剪裁 DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基
化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可
识别和降解外源 DNA 。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点
两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如 E. coR Ⅰ，第 1 个字母 E( 大写 ) ，为大肠杆菌 (E.coli)
属名的第一个字母，第2、 3 两个字母co （小写）为种名头两个字母，第 4
个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
（二）核酸的酸碱性质：
核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于 DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
（三）核酸的紫外吸收：
嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在 260nm 附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
（ 1）可用于测样品纯度（测吸光度 A ）：
A260/A280 比值，纯DNA 应大于 1.8，纯RNA 应达到 2.0，若样品混有杂
对于纯样品，从 260nm 的A 值即可算出含量。
A 值为1，相当于50μ g/mL
（ 2）DNA 双螺旋，或40μ g/mL
核酸的摩尔磷吸光系数ε（
单链 DNA （或 RNA ），或
P）：为含有 1 克原子磷（
20μ g/mL 寡核苷酸。
30.98g）的核酸在260nm 处的吸光系数。
ε（ P） = A / CL. = 30.98 A / W L
A ：吸收值， C ：每升溶液的磷摩尔数， C=W/30.98 ，
L ：比色杯内径。
一般天然 DNA ε（ P ）为 6600， RNA 为 7700~7800
由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，使紫外吸收比单链减少，由此可判断 DNA 是否变性。
DNA 变性时ε（ P ）值升高，增色效应。
DNA 复性时ε（ P ）值降低，减色效应。
P ）低 40~45% 。
（ 1） 变性：核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链，不涉及共价键的断裂。
降解：多核苷酸骨架上共价键（
3‘ ， 5‘- 磷酸二酯键）断裂，分子量降低。
引起变性因素：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素，甲醛等）变性（竞争形成氢键）。
DNA 变性温度：又称熔点或熔解温度，为 DNA 双螺旋结构失去一半时的温度，用 T m 表示， DNA 的 T m 一般为 82~95 0C 。
DNA 变性是爆发式的，变性在一个很窄温度范围内发生。
P508 图 14-4 为 DNA 变性过程。
影响 T m 的因素： 1. DNA 的均一性：均一则
T m 窄，如 poly (A - T) ， poly d(G - C)等， T m 窄。
2. G- C 含量： T m 值与 G- C 含量成正比， G- C 含量越高， T m 值越高，因为 G- C
间三个氢键。
G- C 含量与 T m 关系的经验公式：
G- C% = (T m - 69.3) × 2.44
可由 G- C 含量计算 T m 或由 T m 计算 G- C 含量。
3. 介质离子强度：
离子强度较高时， DNA 的 T m 值较高， DNA 较稳定，因此 DNA 的保存在
含盐（如 1mol NaCl ）缓冲溶液中。
RNA 的变性： RNA 分子中有局部双螺旋区，所以也可发生变性，只是 T m 值
较低，且范围较宽
双链 RNA 变性几乎与
DNA 同。
（ 2） 复性：变性 DNA 在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程
称为复性。
变性 DNA 在缓慢冷却时，可以复性的过程称为退火。
加热变性的
DNA 防止复性，需骤冷处理。
为
DNA 复性，浓度越大复性越快，且具有多重复序列的复性快。
（ 3） 核酸的杂交：不同来源的
DNA 热变性后慢慢冷却，若异源
DNA 之间某些区域
有相同序列，则复性时会形成杂交
DNA 分子。
DNA 与互补的 RNA 之间也可发生杂交。
核酸杂交应用广泛，可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的
DNA 片
断，将少量基因钓出，是基因芯片，基因探针的工作根据。
核酸比所含核苷酸单体的ε（
（四） 核酸的变性、复性及杂交：。