《基因工程技术》PPT课件

72℃，延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
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标准的PCR反应条件
10×缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶
Mg2+
10 μL 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2μg
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1、反转录PCR(RT-PCR) 2、反向PCR 3、复合PCR 4、不对称PCR 5、嵌套PCR 6、实时定量PCR
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类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加 热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温 度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火， 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下 得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是 一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循
⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。
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（1）变性
使双链DNA解链为单链,95℃ 3～5分钟
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定, 适宜的退火温度大约低于引物 Tm值45-55℃ ，介于45-55℃ 。增加温度能减少引物与模板的非特 异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸
3. 法医学中的基因和亲子鉴定
4. 考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定
5. 基因动、植物的检测
⑴转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。
⑵转基因植物的检测：玉米、大豆等。
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③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用 下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。
注:每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的 基因扩增放大几百万倍
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1、缓冲溶液 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 2、耐热DNA聚合酶 3、脱氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs) 4、模板DNA 5、上游引物、下游引物
④dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚 合酶的活性。
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（4）模板 ①单、双链DNA均可。
② 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 ③一般100ng DNA模板/100L。 ④模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（5）引物浓度
0.1-1mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
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（2）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
0.5-5 U/100L 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（3）dNTP
①dNTP浓度取决于扩增片段的长度
② 四种dNTP浓度应相等,一般为50-200mol/L
③浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量
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（1）、PCR反应缓冲液
①Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 ②1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 ③Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。 ④Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 ⑤EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
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①引物长度一般以15～30bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间 退火而影响有效扩增。
②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自 身不能形成发夹结构。
③G/C和A/T碱基均匀分布， G/C含量在45～55%之间，引物碱基序列尽可 能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。
④要避免两个引物间特别是3′末端碱基序列互补以及同一引物自身3′末端 碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
⑤引物3′末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3′末端为G、C或T时 引发效率较高。
⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制 性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和 表达，但其保护碱基有一定的要求。
环的不断重复。
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①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95℃左右一定时 间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使 之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链 后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结 合；
2.5U
1.5mmol/L
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（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开， 无菌操作
（二）设立对照 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外 的所有组分
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灵敏度高
1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水
平 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌
简便、快速
1.一次性加好反应液，2～4 h完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
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1. 基础研究 ⑴基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 核苷酸序列,用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。 ⑵基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。 2. 医学 ⑴感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核杆菌、乙肝病毒等。 ⑵遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。 ⑶恶性肿瘤的诊断。