肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白质组学分析

肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白质组学分
析
作者：施孟如，林全，郑易，王良兴
【摘要】目的：建立肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液的双向电泳图谱，分析二者蛋白质表达的差异和特点。

方法：选取肺腺癌伴胸腔积液标本12例，肺鳞癌伴胸腔积液标本8例，以固相pH梯度等电聚焦为第一向，垂直板SDS-PAGE为第二向分离胸水蛋白质，银染显色，扫描仪获取凝胶图像并对其进行分析。

结果：同组实验重复3次，其中肺腺癌胸腔积液蛋白质点平均(376±17)个，同组匹配率为88.3%;肺鳞癌胸腔积液蛋白质点平均(383±21)个，同组匹配率为86%。

经软件分析，肺腺癌胸腔积液中表达增高2倍的差异蛋白点29个，降低50%的蛋白质点50个。

有3个点仅在肺腺癌胸腔积液表达，5个点仅在肺鳞癌胸腔积液中表达。

结论：肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白可能是不同病理类型的肺癌细胞分泌的特殊蛋白或特异性蛋白标志物。

【关键词】胸腔积液;肺腺癌;肺鳞癌;双向电泳;蛋白质组
肺癌是引起胸腔积液最常见的原因之一[1]。

目前临床上主要采用胸水脱落细胞以及实验室生化检查等方法来鉴别胸腔积液的原因。

利用双向电泳分离蛋白质，能够从大量蛋白质中直接筛选出特异蛋白质，为很多疾病的发病机制研究和临床诊断提供依据[2-3]。

本研究利用双向凝胶电泳技术分析肺腺癌与肺鳞癌胸水的蛋白质组，试图为寻找不同类型肺癌相关蛋白或特异性蛋白标志物打下基础，为肿瘤的诊断、分型、药物研究带来新的思路和途径。

1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、超纯尿素(ultraurea)、硫脲(thiourea)、3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰氨、固相pH干胶条(17 cm，pH 4～7)，Bio-lyte pH 3～10，2-D clean up 试剂盒等(Bio-Rad公司);蛋白酶抑制剂混合液protase inhibitor cocktail(Sigma公司)，所有溶液均用MilliQ水配制。

PROTEAN IEF CELL等电聚焦仪，PROTEAN Ⅱ Xi垂直板电泳仪及其附件，GS-800扫描成像系统，PDQuest凝胶图像分析软件(Bio-Rad公司)，UV2800紫外可见分光光度计(上海尤尼柯公司)。

1.2 标本来源温州医学院附属第一医院2007年11月-2008年6月门诊及住院患者20例，年龄32～78岁。

肺腺癌伴胸腔积液12例，肺鳞癌伴胸腔积液8例，所有病例均经支气管镜组织活检和刷取涂片细胞学检查所确诊。

1.3 实验方法
1.3.1 标本制备：每例胸腔积液标本各取10 mL，同组标本混合后4 ℃，4 000 r/min 离心10 min，取上清液。

所有标本按照1:4(V/V)比例加入10% TCA-丙酮溶液，混匀后于-20 ℃放置过夜，4 ℃，14 000 r/min，离心30 min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮，4 ℃，14 000×g，离心5 min，洗2次，弃上清，沉淀用裂解液(8 mol/L 尿素，4% CHAPS，50 mmol/L DTT，0.2% Bio-Lyte )重悬后用Bradford 法[4]测蛋白质浓度，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 双向凝胶电泳：参考文献[5]方法，根据样品情况适当改进。

第一向——固相pH梯度等电聚焦凝胶电泳，采用低电压胶内泡胀法，将200μg蛋白样品与上样缓冲液(8 mol/L尿素，2% CHAPS，50 mmol/L DTT，0.2% Bio-Lyte，0.001%溴酚蓝)共300μL混合后加入聚焦盘中，选用pH4～7线性17 cm胶条，IPG胶条胶面朝下放入水化液，加盖3 mL矿物油。

聚焦参数见表1。

等电聚焦后的IPG胶条依次在含1% DTT和
2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液(6 mol/L尿素，2% SDS，50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，20%甘油)中各平衡15 min，转移至8%～16% 线性梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封顶。

第二向——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：以恒流10 mA/gel电泳15 min，再加大电流至30 mA/gel直至溴酚蓝达到胶的底端。

按照文献[6]方法进行高灵敏度的银染。

1.3.3 凝胶图像的采集和分析：凝胶用GS-800图像扫描仪透射扫描，分辨率为：63.5×63.5 microns。

图像配比分析采用
2 结果
2.1 肺腺癌胸腔积液组和肺鳞癌胸腔积液蛋白质双向电泳图谱的建立在相同条件下，同组实验重复3 次。

用PDQuest软件分析，其中肺腺癌胸腔积液蛋白质点平均(376±17)个，同组匹配率为88.3%; 肺鳞癌胸腔积液蛋白质点平均(383±21)个，同组匹配率为86%。

蛋白质双向电泳图谱(见图1)，从左到右等电点增加，从下往上分子质量增加。

2.2 肺腺癌胸腔积液和肺鳞癌胸腔积液双向电泳图谱蛋白质
点的差异分析两组胸腔积液双向电泳图谱经软件分析，肺腺癌胸腔积液中表达增高2倍的差异蛋白点29个，降低50%的蛋白质点50个。

有 3个点仅在肺腺癌胸腔积液中表达，5个点仅在肺鳞癌胸腔积液中表达具有较好的重复性。

A，B，C三图为点SSP5204，SSP1307，SSP3114放大图，图中可见3个蛋白质点在鳞癌胸腔积液中的表达明显高于腺癌。

C，D二图为点SSP4003，SSP3115放大图，图中可见在鳞癌胸腔积液中的表达明显低于腺癌。

3 讨论
蛋白质组(proteome)是指在特定的时间和空间上，一个细胞或一个组织基因组所表达的全部相应蛋白质，包括各种亚型及蛋白质修饰，它随着时间和外周因素的影响而呈动态变化[7-8]。

不同的疾病或同一疾病不同的发展阶段，其细胞内和体液中蛋白质表达存在差异，这些差异表达的蛋白质往往与疾病的发生和发展有着直接或间接的关系[9]。

双向电泳作为目前蛋白质研究中最为广泛应用的技术平台，可以被用来分析疾病的蛋白质表达差异及其特异标志物，也可以根据蛋白质的差异程度对疾病进行诊断[10]。

目前临床上主要采用胸水脱落细胞以及实验室生化检查等方法来鉴别胸腔积液的原因，但是仍有相当一部分恶性胸腔积液不能被明确。

直接胸腔积液进行蛋白质表达的差异分析，是通过非损伤途径识别肿瘤标志物的更佳途径[11]。

通过分析、比较肺腺癌和肺鳞癌胸腔积液中的差异蛋白质，可能发现不同病理类型肺癌的相关蛋白质以及特异性蛋白标志物[12]。

本实验结果中，肺腺癌胸腔积液图谱经扫描分析发现本组独有蛋白质点为3个，肺鳞癌胸腔积液独有蛋白质点为5个，这些蛋白质点很可能是不同类型肺癌细胞分泌的特有蛋白质。

部分蛋白质点应该是已知的肿瘤标志物，部分蛋白质很可能是尚未发现的肿瘤标志物，这对寻找未知的肺癌肿瘤标志物具有重要的意义。

肺腺癌胸腔积液组和肺鳞癌组相互匹配的蛋白质点中，其腺癌组比鳞癌组上调大于2倍的蛋白质点有29个，下调大于50%的蛋白质点有50个。

说明两组胸腔积液中某些相同的蛋白标志物，在其功能和数量上仍有一定的差别，通过测量蛋白质点的染色强度来获得蛋白质定量信息，这可作为鉴别以上两组胸腔积液的另一指标。

但是利用双向电泳差异蛋白质分析作为技术平台，只能获得蛋白质的初步信息，而蛋白质的具体结构和功能必须经质谱或其他分析手段作进一步分析，并结合western璪lot或基因组等其他实验技术来进行验证。

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