.蛋白质与酶工程实验

实验一固定化酵母细胞及蔗糖酶的检测
一、实验目的
1. 掌握固定化酵母的方法，从而获得固定化蔗糖酶。

2. 掌握蔗糖酶活力的测定原理及还原糖的定性检测法。

二、实验原理
酵母细胞中富含蔗糖酶，蔗糖酶能将蔗糖转化成果糖和葡萄糖，葡萄糖和果糖
同为六碳单糖，分子式为C
6H
12
O
6
，但化学结构不同，前者为醛糖，后者为酮糖。

斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红
色的Cu
2
O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。

三、仪器和试剂
仪器：
三角瓶（1）、注射器（1）、试管（2）、水浴锅。

试剂：
1、海藻酸钠50克；
2、活性酵母150克；
3、 10％蔗糖液：称取100克蔗糖用水定容至1000毫升；
4. 斐林甲、乙液：各50ml。

5、4％氯化钙溶液（180克氯化钙溶于4320克水中）
四、操作步骤
l、称取海藻酸钠0.5克加入50毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的1.0克活性酵母的悬液加入混匀。

然后用注射器吸取，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中（150毫升），制成直径2
－3毫米的球形固定化酵母。

刚形成的凝胶珠应在CaCl
2
溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。

将此固定化酵母装入三角瓶中，加入10％的蔗糖液30毫升。

经固定化酵母水解30~40分钟，其成分为葡萄糖和果糖的混合液。

2、蔗糖酶的检测
吸取斐林甲、乙液各1毫升于干燥试管中，加入水解液1毫升，沸水中保温，观察颜色反应。

有氧化亚铜沉淀的则说明蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。

空白以10％蔗糖液做对照，其它同上。

斐林试剂甲：NaOH溶液，其浓度为0.1g/ml。

斐林试剂乙：CuSO4溶液，其浓度为0.05g/ml。

斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。

用斐林试剂鉴定可溶性还原色的Cu
2
糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。

思考题：
1、细胞和酶的固定化有哪些方法？本实验中固定化酵母细胞属何种方法？
2、有哪些方法可以终止酶的催化反应？
3、固定化细胞催化有何特点？
实验二果葡糖浆的酶法生产
一、原理：葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，果葡糖浆是葡萄糖和果糖的混合糖浆。

葡萄糖异构反应平衡时，可将40~50%的葡萄糖转化为果糖，人们将这种葡萄糖与果糖混合的糖浆称为果葡糖浆。

二、实验材料、仪器和试剂
(1)恒温水浴锅
⑵磷酸缓冲液(pH值7.5)
⑶固定化葡萄糖异构酶
⑷激活剂：0.5M硫酸镁溶液
⑸70％(W/V)葡萄糖溶液
⑹1.5％(W/V)半胱氨酸盐酸盐溶液
⑺0.12％(W/V)咔唑酒精溶液
⑻硫酸溶液
⑼恒流泵
⑽分光光度计
⑾玻璃夹套柱
三、操作步骤
⑴取合适量的酶(用固定化酶完整颗粒,不磨碎),加0.02M磷酸缓冲液 (pH7.5) 适量，浸泡0.5h。

⑵开启恒温水浴，温度调节为60~65℃。

⑶倾去浸泡固定化酶的磷酸缓冲液，将用固定化酶完整颗粒装入玻璃夹套柱内，保持60~65℃。

⑷向葡萄糖溶液30mL中加入硫酸镁溶液10mL, 加水至总体积100ml，充分溶解。

⑸利用恒流泵，将加入硫酸镁的葡萄糖溶液自反应柱底部泵入。

⑹收集反应液，适当稀释，测定滤液的果糖含量或作定性鉴定。

试剂配制
1、70％(W/V)葡萄糖溶液:称取70克分析纯葡萄糖加入煮沸的蒸馏水中,再加热使其完全溶解,冷却用蒸馏水定容至100mL。

2、pH7.5磷酸缓冲溶液: 0.2M磷酸二氢钠(GB 1267)溶液:称取3.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),用蒸馏水溶解并稀释至100mL。

0.2M磷酸氢二钠(GB 1263)溶液:称取7.16g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),用蒸馏水溶解并稀释至100mL。

取一定量上述二溶液混合,用pH计校正pH至7.5。

3、0.5M硫酸镁溶液:称取6.15g硫酸镁(MgSO4·7H2O),加蒸馏水溶解,用蒸馏水定容至50mL。

果糖测定法(半胱氨酸-咔唑法) )
1、试剂
⑴1.5％(W/V)半胱氨酸盐酸盐溶液:称取生化试剂纯半胱氨酸盐酸盐0.375g,用蒸馏水溶解,并稀释定容至25mL。

⑵0.12％(W/V)咔唑酒精溶液:称取咔唑30.0mg,用无水酒精溶解并定容至
25mL,放置在棕色瓶中,24h后使用。

⑶硫酸溶液:量取分析纯浓硫酸90mL,在不断搅拌下徐徐倒入38mL蒸馏水中。

2、测定果糖
反应终止后(加高氯酸HCLO4 0.5M一滴,或100度沸水终止)溶液适当稀释后,吸取0.5mL, 然后每管中加入0.1mL半胱氨酸盐酸盐溶液,3mL硫酸溶液,摇匀后,立即加入0.1mL咔唑酒精溶液,摇匀,于60℃水浴中保温10min,取出用水冷却呈红紫色（可作定性鉴定）,用10mm光径的比色皿,在560nm波长下比色测定（可作定量测定）。

⑴果糖标准曲线的制作：
①标准果糖溶液：称取预先在55℃真空干燥至恒重的分析纯果糖125.0mg，用蒸馏水定容至25mL(5mg/mL)，存放于冰箱中备用。

使用时稀释100倍(50ug/mL)。

②标准曲线的绘制：取4支试管，按表1顺序加入试剂，进行操作，每加入一种试剂后应立即摇匀。

以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/mL）为横坐标作图得标准曲线。

表1 果糖测定 (半胱氨酸-咔唑法)—标准曲线的制作
管号 1 2 3 4 5
果糖标准溶液/ mL（50ug/mL）0.0 0.1 0.2 0.4 0.5 纯水/ mL 0.5 0.4 0.3 0.1 0.0 半胱氨酸盐酸盐溶液/ mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 硫酸溶液/ mL（摇匀） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
咔唑酒精溶液/ mL（振荡）0.10.10.10.10.1 OD560
60℃水浴保温10min，然后自来水冷却，于560nm处比色。

⑵反应液果糖含量的测定：
将反应液液稀释，使其果糖含量在10-40ug范围内，准确吸取0.5 mL，每种样品液做3个重复，按表2加样，参照标曲绘制的操作，测定吸光度。

根据获得的吸光度在标准曲线图上查得相应的果糖量。

表2 果糖含量的测定
管号 1 2 3 4
样品/ mL 0.0 0.5 0.5 0.5
纯水/ mL 0.5 0 0 0
半胱氨酸盐酸盐溶液/ mL 0.1 0.1 0.1 0.1 硫酸溶液/ mL（摇匀） 3.0 3.0 3.0 3.0
咔唑酒精溶液/ mL（振荡）0.1 0.1 0.1 0.1 OD560
60℃水浴保温10min，然后自来水冷却，于560nm处比色。

四、实验数据处理
⑴果糖含量
果糖（g/mL）=(F*n)/(106)
式中：F---由标准曲线所得的果糖含量，ug/mL
n---样品稀释倍数
106---单位换算
⑵葡萄糖转化率
葡萄糖转化率（%）=样品中果糖含量/21%*100%
式中： 21%---为底物溶液中葡萄糖含量（g/mL）。