大肠杆菌基因工程

GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
❖启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
P
存在时，整个操纵子处于基 乳糖 异丙基-β-D-硫
底水平表达；
代半乳糖苷（IPTG）
诱导物可以使启动子Plac 介导的转录大幅提高。
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次 完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基 因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。
几年后，第一个基因工程产品—利用构建基因的基因工 程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的 产业时代。
基底水平转录 阻遏蛋白
O
诱导
高效转录
PO
乳糖启动子Plac的可控性： cAMP
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促
CAP
Plac
葡萄糖代谢
进Plac介导的转录。
高效转录
O
cAMP浓度降低 基底水平转录
葡萄糖代谢使cAMP减少， 也能阻遏Plac介导的转录。因 此，基因工程中使用的乳糖 启动子均为抗葡萄糖代谢阻 遏的突变型，即Plac UV5。
pKO1
galK
报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养 ori 基中的半乳糖酵解成红色素物质。
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
❖启动子的构建
启动子
PL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
-10 区序列
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）启动子
❖启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
❖启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克
隆到启动子探针质粒pKO1上；
Apr
受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上
Plac O
高效转录
Plac UV5 O
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸阻遏蛋白复合物的阻遏，转
阻遏蛋白
录呈基底状态； 在培养系统中去除色氨酸或
Ptrp
除去色氨酸
者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
便可有效地解除阻遏抑制作用。
色氨酸
基底水平转录
Otrp
或加3-吲哚丙烯酸 （IAA）
细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举 足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史 最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。
7-1. 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌 无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结 构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。
2. 强终源自文库子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上
的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf；
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落， PL便可介导目的基因的表达. 但在大型细菌培养罐中迅速升温Ptrp 非常困难，因此常使用一个双质粒 控制系统，用色氨酸间接控制目的 基因表达。
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸
PL
A
目的基因 B
表达 B
（二）终止子
1. 强化转录终止的必要性
❖外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录 过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质 粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物；
❖过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的 表达。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间 就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功 能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶 在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导 致重组质粒的不稳定性；
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
高效转录
在正常的细菌培养体系中,除 去色氨酸是困难的，因此基因 工程中往往添加IAA诱导Ptrp 介导的目基因的表达。
Ptrp Otrp Ptrp Otrp
高效转录
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白 阻遏，很难直接诱导控制。在基 Ptrp 因工程中常使用温度敏感型的cI 突变基因cI857控制PL。
对于一些终止作用较弱的终止子， 通常可以采用二聚体终止子串联的特 Apr 殊结构，以增强其转录终止作用；
终止子序列
Tcr pCP1
终止子也可以象启动子那样，从细 菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。
ori 筛选Apr、Tcs的转化子
（三）核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序 列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
1. 核糖体结合位点的结构
四个特征结构要素：
Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个 核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架 的起始位点,但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；