大肠杆菌基因工程
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程大肠杆菌生产胰岛素的流程
基因工程大肠杆菌生产胰岛素的流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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第三章大肠杆菌基因工程-1
Plac -lacI 调控模式的问题与策略
问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
目的基因
cI857 PL B
吲哚丙烯酸，IAA）。
T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子
T7启动子——最成功的启动子
*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合
酶的快 5 倍
*由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。
P
O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子的筛选
采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
第十四章：大肠杆菌基因工程
②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测
其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。
若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针质粒pKO1上， 受 体 细 胞 染 色 体 DNA 上 的 galE 、 galT 与质粒报告基因galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解 成红色素物质。
②色氨酸启动子Ptrp的可控性
Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然
处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温
度进行诱导表达。
二．终止子
外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会 影响外源基因的表达，原因如下：
③滤膜结合法分离
原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测 DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后 再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说， 这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通 常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’
，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：以AUG；GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。
C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱
去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，工 艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
人胰岛素的生产方法
利用基因工程菌发酵生产人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素， 成为世界上第一个上市的基因工程药物；1987年，Novo公司又推出
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： 化学合成A链 和B链的编码
Apr
tac
Met b-Gal Met A peptide Apr
tac
Met b-Gal Met B peptide
序列
ori
ori
M
M
M
M
N
C
N
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
b-Gal
外源基因在原核细胞中的表达
现将真核基因在原核细胞中表达： 1、外源基因克隆在表达载体并导人宿主菌。
2、外源基因不能有间隔序列(内含子)，因而必须用cDNA或全
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物，对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上，人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原，然后进行化学合成和结构改 造。然而，这种方法不仅成本高昂，而且生产周期长，难以满足市场需求。近 年来，随着生物技术的发展，利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来，基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入，我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域（如纳米技术、生物信息学等）的跨学科合作，将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤：
1、细胞悬浮：将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中，在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况，以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵：当细菌生长到一定密度时，向发酵罐中加入适量的诱导剂，以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数，以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中，基因工程技术得到了广泛应用，并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素， 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而，重组人胰岛素的生产过 程比较复杂，需要经过多个步骤，因此生产成本较高。
3、收集：发酵结束后，收集细菌培养液并进行过滤，以去除其中的杂质和细 胞残骸。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的
研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是利用基因工程
技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中，并使其表达和分泌人类
胰岛素。
研究的具体步骤如下：
1. 克隆：将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌中的表达载体上，构建重
组胰岛素的基因工程菌株。
2. 表达：将重组胰岛素基因工程菌株进行培养和诱导表达，启动胰岛
素基因的转录和翻译，使其合成胰岛素多肽链。
3. 折叠：由于胰岛素中存在多肽链的结构，其需要正确折叠形成活性
结构。
通过培养条件的调控和辅助分泌蛋白的表达帮助胰岛素多肽链
正确折叠。
4. 分泌：经过折叠的胰岛素多肽链进入细胞分泌途径，通过胞外酶切，胰岛素分泌至外部培养液中。
5. 纯化：将培养液中的胰岛素进行纯化，去除其他杂质，得到纯度较
高的重组人胰岛素。
这种方法相比其他表达系统有以下优势：
1. 大肠杆菌生长快速且易于培养，并且具有可高效表达外源基因的能力。
2. 人类胰岛素的基因序列已经大量研究，其表达也相对成熟和稳定。
3. 大肠杆菌发酵工艺相对简单，易于工业化生产。
4. 经过纯化的重组胰岛素具有较高的活性和纯度，适用于临床应用。
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
大肠杆菌基因工程资料
Prec
A Ptra A Ptrp
T A T G A T
T A A G A C T T G A C A T A T T A C T A T G A C
T A T A A
T A A T G T T A A C T A T A A T A T A A T
Plac Ptac
Ptac = 3 Ptrp A = 11
大肠杆菌基因工程菌构建
• 包涵体型异源蛋白的表达
• • • • • 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
大肠杆菌工程菌构建
这些构建大肠杆菌工程菌的方法，都是利 用大肠杆菌本身特性，来达到目的基因高效、 稳定、快速表达。
大肠杆菌基因工程实例
• 胰岛素的合成 • 早期人类从动物体内直接提取，生产效率 低。 • 化学合成 用化学方法合成，成本高 • 基因工程 以大肠杆菌为受体生产胰岛素
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 A链和B链同时表 达法
Ap
r
建
转
化
M
N
ta c
Me
t bGal Me t B Apeptide
分杆菌，再将目的基因的载体转移到大肠 杆菌中。
启动子
启动子最佳距离的探测
A
E
E
目的基因
A 酶切 E
E 启动 子
开
Bal31酶 解
1
启动子
启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针pko上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT
M
化
C
CNBr 处
ori
peptide 化学合成AB链编码序
基因工程3大肠杆菌表达系统
01
02
最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。
第一节基因的表达系统与表达策略
容易获得较高浓度的细胞；
01
能利用易得廉价原料；
02
不致病、不产生内毒素；
03
发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
04
容易进行代谢调控；
05
容易进行DNA重组技术操作；
06
产物的产量、产率高，
07
产物容易提取纯化。
08
适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
宿主细胞的选择
01
原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；
02
真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
宿主细胞分为两大类：
真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
让外源蛋白质定位在周质或胞外表达； 使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株； 将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长； 使目标基因以融合蛋白形式表达； 置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点； 对目标蛋白质作疏水性修饰。 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：
常用的大肠杆菌表达载体
01
最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。
03
迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。
大肠杆菌在生物工程中的应用研究
大肠杆菌在生物工程中的应用研究大肠杆菌是一种常见的细菌，属于革兰氏阴性菌，可以在大肠内生长繁殖。
它是一种典型的模式微生物，也是生物工程中的重要研究对象。
在生物工程中，大肠杆菌不仅可以用作基因工程载体，还可作为研究重要蛋白质的工具。
今天，我们就来探讨大肠杆菌在生物工程中的应用研究。
大肠杆菌在基因工程中的应用研究在生物工程研究中，大肠杆菌作为载体在基因克隆、表达和突变等方面被广泛应用。
其中，基因克隆是指将感兴趣的基因从其它生物中分离出来并插入大肠杆菌染色体中，使它们具有在大肠杆菌中表达的能力。
基因表达指利用大肠杆菌表达人类或其它生物的重要蛋白质，例如生长因子、免疫球蛋白等等。
基因突变指在大肠杆杆菌中引入人为突变，以研究这些基因对细胞机制、代谢调节等方面的影响。
基因克隆是利用大肠杆菌的DNA重组技术实现的。
当染色体DNA遭受化学或物理作用而断裂时，通常会出现两种不同的DNA断裂形式：端断和内切。
大肠杆菌中，当外源DNA准备进入宿主细胞时，这些DNA可以直接与大肠杆菌染色体DNA发生重组，从而允许特定基因的插入和删除。
这充分说明了大肠杆菌在基因工程中的应用优势。
大肠杆菌在重要蛋白质的表达中的应用研究大肠杆菌一直被用作研究生物技术和药物开发的重要工具。
它具有高效表达目的基因和纯化重要蛋白质的功能，特别是在产生重要的生物医药品方面，大肠杆菌有着较为显著的优势。
例如，大肠杆菌用于表达疫苗和生物制品、裂解蛋白和其他生物大分子材料，这些产品通过利用大肠杆菌的表达系统生产。
这个系统专门用于生产疫苗和生物制品，并为生物药物产业提供可靠和高效的货源。
另外，大肠杆菌的生物合成能力在蛋白生产和制定新型蛋白的过程中得到了广泛应用。
一些蛋白本身的结构和物理化学特性就能够在大肠杆菌进行生产。
目前，大肠杆菌在表达酶类和仅含小分子的特殊蛋白方面已经有了较好的基础。
通过使用基因工程方法构建不同的蛋白表达平台，在基因表达、突变物的制成和纯化方面，具有很大的应用潜力。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌是微生物中最为普遍的种类之一，其在生物工程研究中也扮演着重要角色。
大肠杆菌不仅因关系到人类营养和生态环境而广泛应用，而且由于其生长繁殖迅速，具有
良好的遗传性状以及可调控性强等特点，在基因工程中的应用也得到了越来越多的关注。
首先，大肠杆菌可以用于制备新型微生物色素。
由于大肠杆菌的膜蛋白性状和抗病毒
的质量，它们能够用于制造出自然结构完整的大肠杆菌色素。
这些色素能够用于抗肿瘤药
物的开发。
大肠杆菌色素可以被用来改变多种抗病毒活力，使它们更有效地抑制肿瘤细胞
的生长。
此外，大肠杆菌还可以用作基因表达系统。
它可以被用来做基因组挖掘和表达分析，这些工作为药物研发提供有价值的信息，例如新型药物的发现和开发，重组蛋白的制造和
功能的研究。
此外，大肠杆菌也可以被用作能够识别细菌毒素的选择性培养介质，从而检
测特定的病原体。
最后，大肠杆菌可以作为能够大量合成药物以及相关产品的“小工厂”，如重组植物
激素、抗生素和其他生物活性物质。
大肠杆菌是一种极具潜力的生物反应器，可以稳定生
产大量重要化学物质，并长期保持较高的性能质量。
此外，它还可以用作研究新颖的化学
过程的实验室，不仅可以证明一种化学反应是可行的，还可以利用实现它们的生物工程技
术来建立化学工厂，产生更大规模的产品。
综上，大肠杆菌具有良好的基因组可调控性，能够快速繁殖，形成色素，稳定表达，
能产生多种活性物质，检测病原体以及应用于研究新型化学过程等特性，这些特性都使得
大肠杆菌在基因工程中有着巨大的应用价值,使之成为一种普遍意义上重要的微生物细胞。
基因工程实验方案实验
基因工程实验方案实验一、实验目的本实验旨在利用基因工程技术对大肠杆菌进行基因改造，使其能够表达外源蛋白。
具体来说，我们将利用质粒载体将感兴趣的外源基因导入大肠杆菌，并通过PCR、酶切、连接、转染等技术，构建表达载体，使其能够在大肠杆菌中表达外源蛋白。
通过本实验，我们希望能够探究基因工程技术在微生物工程中的应用，并为后续的基因改造研究提供实验基础。
二、实验材料1. 大肠杆菌菌种2. 质粒载体3. PCR试剂盒4. 酶切试剂盒5. 连接试剂盒6. DNA电泳仪7. 热循环仪8. 紫外可见分光光度计9. 转染试剂三、实验步骤1. 质粒载体提取首先，从实验室常用菌株中提取质粒载体。
我们选择一株质粒带有多克隆位点的大肠杆菌附着菌株，通过菌株复苏、培养、质粒提取等步骤，从中提取目标质粒载体。
2. PCR扩增外源基因根据我们感兴趣的外源基因序列，设计相应的引物，利用PCR技术扩增目标基因。
在PCR反应过程中，我们需要控制PCR反应的条件和时间，确保外源基因能够被充分扩增。
3. 酶切及连接将目标基因和质粒载体分别进行酶切处理，然后进行连接。
酶切及连接过程中需要保证实验操作无菌、操作准确，以确保目标基因能够成功插入质粒载体中。
4. 构建表达载体通过连接实验，成功将外源基因插入质粒载体中，构建表达载体。
之后，通过DNA电泳、酶切鉴定等技术手段，对构建的表达载体进行验证和鉴定。
5. 大肠杆菌转染将构建的表达载体转染至大肠杆菌，使其内源化。
转染过程中需要严格控制转染条件，保证外源基因能够成功表达。
6. 蛋白表达检测经过转染后，我们将进行蛋白表达检测。
通过蛋白印迹、Western blot、质谱等技术手段，对外源蛋白的表达情况进行检测和分析。
7. 结果分析最后，对实验结果进行分析，包括目标基因的扩增情况、质粒构建情况、大肠杆菌转染情况以及蛋白表达情况等，总结实验结果。
四、实验注意事项1. 实验操作需严格遵守无菌操作规范，确保操作台面、设备、试剂均处于无菌状态。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体
技术创新
随着技术的不断进步，基因工程32大肠杆菌克隆载体的效率和安全性将得到提高。法规完善
随着基因工程-32大肠杆菌克隆载 体的应用范围扩大，相关法规和 监管体系也将逐步完善，为技术 的健康发展提供保障。
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利用基因工程手段改造微生物，提高微生物对污染物的降解能力，实现对环境污染的生 物修复。
生物监测
通过基因工程技术构建具有特定功能的微生物，实现对环境污染物的实时监测和预警。
05
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体的挑战与前景
安全性问题
潜在的健康风险
基因工程-32大肠杆菌克隆载体可能含有对人体有害的基因或基因 片段，导致基因突变或产生新的疾病。
环境影响
基因工程-32大肠杆菌克隆载体可能对环境造成破坏，如基因污染、 生态失衡等。
长期影响未知
由于基因工程-32大肠杆菌克隆载体的应用时间较短，其长期对人 体和环境的影响尚未完全明确。
伦理问题
01
02
03
人类基因干预
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体涉及到对人类基因 的干预，可能引发伦理争 议。
基因歧视
1990年代
人类基因组计划启动，推动了基因组学和功能基因组学的研究。
21世纪
基因编辑技术的发展，如CRISPR-Cas9系统，使得对DNA的精确编辑成为可能。
基因工程的应用
医药领域
用于药物研发、疾病诊断和治疗，如胰岛素、 生长激素和肿瘤免疫治疗等。
工业领域
用于生物燃料、生物塑料和生物酶的生产， 以及环境污染的生物治理等。
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体的应用可能导致基 因歧视现象的出现，对某 些人群造成不公平待遇。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌在基因工程中的应用大肠杆菌是一种常见的细菌，因为其易于培养和遗传学特性而成为了基因工程的重要模型生物之一。
基因工程是人类利用分子遗传学、细胞生物学等技术手段对生物体进行基因改造的过程，使其实现某些人类所需的生物学功能。
本文将深入介绍大肠杆菌在基因工程中的应用。
一、大肠杆菌在DNA重组中的应用DNA重组是指将不同来源的DNA进行拼接、克隆或删除等操作来改变基因的结构和功能。
大肠杆菌是一种真正的工程菌，在DNA重组中有着重要的作用。
因为大肠杆菌的染色体只有一根，而且细胞的分裂时期只有30分钟左右，这就为大肠杆菌的DNA重组提供了非常便利的条件。
利用基因工程技术，可以将人类需要的目的基因克隆到大肠杆菌中，并利用大肠杆菌代谢途径的生物反应来合成所需要的特定蛋白。
此外，大肠杆菌也可以通过作为载体来传播适当的DNA。
大肠杆菌的细胞质中有着非常多的质粒，这些质粒可以独立于染色体进行复制和表达。
这意味着我们可以把重要的基因克隆到质粒上，利用大肠杆菌作为载体携带质粒将其引入真核细胞中。
这样，大肠杆菌及其质粒成为了一种高效的基因转移方法，为生命科学和生物技术中的基因治疗、基因诊断和疫苗等的研究带来了无限的可能性。
二、大肠杆菌在蛋白质表达中的应用大肠杆菌非常适合用于蛋白质表达，因为大肠杆菌具有快速繁殖、生长周期短和容易生长等优点。
在常规的重组蛋白制备过程中，研究人员常常使用大肠杆菌作为表达主机，将重组蛋白基因导入到大肠杆菌中，然后通过不同的表达条件来诱导基因表达，最终得到高含量且纯度较高的重组蛋白。
这项基因工程技术具有质量稳定、生产过程简单和成本低等优点，因此在医药生物领域的蛋白质药物和医用耗材领域受到广泛应用。
三、大肠杆菌在基因敲除中的应用基因敲除是一种通过人工手段消除某些基因表达功能的方法。
大肠杆菌是一种常见的基因敲除菌种。
利用基因敲除技术，研究人员可以选择性地删除大肠杆菌的某些基因，以了解这些基因在生物体代谢和生理过程中的功能，同时也能够根据需要对基因进行改造，以达到预期的效果。
大肠杆菌基因工程
状态。在培养系统中去除色氨酸
基底水平转录
或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
便可有效地解除阻遏抑制作用。
在正常的细菌培养体系中，除去
色氨酸是困难的，因此基因工程
中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目
基因的表达
色氨酸
或加3-吲哚丙烯酸
高效转录
阻遏蛋白
（IAA）
Otrp
基 因 工 程
湖北师范学院 王友如
04.
03.
02.
01.
高等植物基因工程
取得的成绩与经验
不足之处与原因分析
后续工作计划
基因工程
05.
后续工作计划
06.
后续工作计划
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工母基因工程
存在时，整个操纵子处于基
基底水平转录
底水平表达；诱导物可以使
启动子Plac介导的转录大幅
提高
启动子
启动子的可控性
Plac
乳糖启动子Plac的可控性：
O
Plac
O
高效转录
葡萄糖代谢
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活因子（CAP）结合
区，cAMP激活CAP，CAP
基底水平转录
结合启动子控制区，进而促
占90%以上的绝对优势
密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律
细胞内tRNA的含量
如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；
如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术，它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来，它已广泛应用于医药、农业、工业等领域，为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物，具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病，具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比，重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点，因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤，包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤，可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌，从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状，可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导，进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素，作为一种生物技术产品，在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术，将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内，使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题，影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟（IDF）的数据，全球约有62亿成年人患有糖尿病，预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素，而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性，成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前，糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
基因工程6
一、大肠杆菌的基因工程1大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：①位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；②翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；③SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；④基因编码区5’端若干密码子的碱基序列2密码子的偏爱性：①生物基因组中碱基含量：在富含AT的生物基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势②密码子与反密码子相互作用的自由能规律③细胞内tRNA的含量△外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。
一般而言，有两种策略：外源基因全合成（根据偏爱性设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子）；同步表达相关tRNA编码基因（将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上，构建双质粒系统。
）3大肠杆菌基因工程菌的构建策略①包涵体型异源蛋白的表达在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB优点：↘简化外源基因表达的产物的分离操作：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来↘能在一定程度上保持表达产物的结构稳定缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（具有生物活性）的目标蛋白，但变复性效率不高。
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GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
❖启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基 乳糖 异丙基-β-D-硫
底水平表达；
代半乳糖苷（IPTG）
诱导物可以使启动子Plac 介导的转录大幅提高。
❖过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的 表达。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间 就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功 能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶 在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导 致重组质粒的不稳定性；
高效转录
在正常的细菌培养体系中,除 去色氨酸是困难的，因此基因 工程中往往添加IAA诱导Ptrp 介导的目基因的表达。
Ptrp Otrp Ptrp Otrp
高效转录
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白 阻遏，很难直接诱导控制。在基 Ptrp 因工程中常使用温度敏感型的cI 突变基因cI857控制PL。
基底水平转录 阻遏蛋白
O
诱导
高效转录
PO
乳糖启动子Plac的可控性： cAMP
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促
CAP
Plac
葡萄糖代谢
进Plac介导的转录。
高效转录
O
cAMP浓度降低 基底水平转录
葡萄糖代谢使cAMP减少， 也能阻遏Plac介导的转录。因 此，基因工程中使用的乳糖 启动子均为抗葡萄糖代谢阻 遏的突变型，即Plac UV5。
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次 完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基 因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。
几年后，第一个基因工程产品—利用构建基因的基因工 程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的 产业时代。
对于一些终止作用较弱的终止子， 通常可以采用二聚体终止子串联的特 Apr 殊结构，以增强其转录终止作用；
终止子序列
Tcr pCP1
终止子也可以象启动子那样，从细 菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。
ori 筛选Apr、Tcs的转化子
（三）核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序 列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
1. 核糖体结合位点的结构
四个特征结构要素：
Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个 核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架 的起始位点,但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；
Plac O
高效转录
Plac UV5 O
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸阻遏蛋白复合物的阻遏，转
阻遏蛋白
录呈基底状态； 在培养系统中去除色氨酸或
Ptrp
除去色氨酸
者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
便可有效地解除阻遏抑制作用。
色氨酸
基底水平转录
Otrp
或加3-吲哚丙烯酸 （IAA）
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌 无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结 构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。
2. 强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上
的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf；
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）启动子
❖启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
❖启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克
隆到启动子探针质粒pKO1上；
Apr
受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上
细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举 足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史 最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。
7-1. 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落， PL便可介导目的基因的表达. 但在大型细菌培养罐中迅速升温Ptrp 非常困难，因此常使用一个双质粒 控制系统，用色氨酸间接控制目的 基因表达。
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸
PL
A
目的基因 B
表达 B
（二）终止子
1. 强化转录终止的必要性
❖外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录 过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质 粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物；
pKO1
galK
报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养 ori 基中的半乳糖酵解成红色素物质。
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
❖启动子的构建
启动子
PL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
-10 区序列
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA