第七章植物的脱毒培养

(3) 激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均 很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。
(4) 酶缺乏： 1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需 要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法 在分生组织中复制。 (5) 抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假 说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子，如 “酶钝 化系统” 。
Production of viru-free sweetpotato plants using heatherapy and meristem tip culture. (A) Apical meristem tip (0.25mm with two leaf primordia) used for virus eridcation. (B) Regrowth of meristem tip after 4 weeks of culture on MS medium supplemented with 3% sucrose. (C) An established healthy plant of sweetpotato Abees cultivar obtained form SPFMV-affected plant using heattherapy and meristem tip culture.
病毒危害： 1）导致植物产量和品质的大幅度降低。 2）通过无性繁殖或者种子传给下一代。
荷兰（1619）最早记载植物病毒病是郁金香碎色花病。 20世纪50年代初，法国的Morel 利用茎尖培养法，从患病的大丽花 （西番莲）获得了无病毒，恢复种 性，使品种复壮，提高产量品质。 例如：马铃薯、甘薯、百合、草莓、大蒜、兰花、 苹果等。
热处理脱毒的原理：
⑴ 某些病毒受热后不稳定，高温使这些病毒失去活性， 可以部分地或完全地被钝化。 ⑵ 病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制。热 处理钝化病毒的活性后，病毒在植物体内增殖减缓 或增殖停止，而失去侵染的能力。 ⑶ 高温下，一方面不能生成或生成病毒很少，另一方面对 病毒的破坏作用加重，病毒颗粒生成和破坏的平衡程度 受到破坏，使感染植株的病毒含量不断降低，经过一段 时间，病毒自行消失而达到脱毒的目的。
ELISA-flash
4、电子显微检测法 采用透射电镜的方法，可直接检测出有无病毒的存在，可 得知病毒的大小、形状、结构，并能观察到病毒在器官和 细胞内的分布情况。
电子显微镜分辨能达到0.5μm，可显示细胞与组织中病毒 的精确定位和各种形态变化。 5、核酸分析法： 通过核酸杂交或PCR法 检测目标病毒的核酸序列。
3 抗血清鉴定法
植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是较好的抗原
(antigen）
给动物注射病毒后，动物在外来抗原刺激下产生的免疫球蛋 白，叫做抗体，存在于血清中。含抗体的血清为抗血清。 抗血清的制备：纯化的病毒注射到实验动物中，一段时间后 采集血清。 血清鉴定方法的原理：主要根据抗体和抗原的特异沉淀反应。 具体方法有： 试管沉淀、琼脂双扩散法、免疫扩散、ELISA等。
1、方法：
热水:休眠芽（50 ℃热水浸渍数分钟～数小时） 热气:活跃的茎尖。温度35-50℃，处理时间长度各异。 （处理时间长短可根据病毒浓度、寄主蛋白含量、温度高低来确定） 如：香石竹：38℃，2个月；马铃薯(X、Y病毒)在芽长至1-2cm， 35℃7-28天； 菊花：50℃，3-15min。 长时间高温处理不能提高脱毒效率，反而降低茎尖再生能力，可以 采用逐渐升温、变温处理。 如：马铃薯40℃4h,6-22 ℃20h; 烟草40℃16h,22 ℃8h或者40℃48h,35 ℃ 48h
（四）微体嫁接脱毒
微体嫁接法： 将茎尖（<0.2mm）作为接穗嫁接到实生苗 砧木上，一起在培养基上培养的方法。 适用茎尖难以生根形成植株的一些木本植物。此方法消 除病毒的几率和获得无病毒苗的可能性大，在柑橘和苹果 上获得成功。利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为30%～ 50%，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。 柑橘的银屑病、桃树的洋李环斑病毒、洋李矮萎缩病毒褪 绿叶斑病毒都可以通过微体嫁接获得无病毒苗。
Virus elimination
• why does the meristem have low/ virus titre? no
virus-free tissue
virus particles found here
Tobacco meristem
– virus spreads primarily through vascular system - this is not developed in the meristem – mitosis and chromosome replication compete with virus replication – high auxin in meristem inhibits virus replication – a virus “inactivating” system has greatest activity in meristem
4）外植体的生理状态： 顶芽茎尖比腋芽茎尖效果好。 生长期的材料比休眠期好。
（二）热处理脱毒
热处理（heat treatment）与茎尖培养结合，即可取较大的茎尖培养， 大大提高茎尖成活率和增殖率，又达到消除病毒的目的。 印度尼西亚的爪哇人（1889），甘蔗的枯萎病，在50-52℃热水中， 30min，即可使甘蔗生长良好，达到脱除枯萎病的作用。
三、脱除植物病毒的方法
(一)茎尖培养脱毒
1、根据培养目的和取材大小可将茎尖培养分为: 1）普通茎尖（Shoot tip）培养。 较大茎尖（几毫米至几十毫米的茎尖）培养技术。技术简 单，操作方便，茎尖易成活，成苗所需时间短，能加速繁 殖速度。 2）茎尖分生组织( apical meristem )培养。 仅限于幼龄叶原基顶端圆锥区，其直径和长度大约100～ 250μm，即小于0.3mm的茎尖为茎尖分生组织。
（三）愈伤组织脱毒
研究表明，在愈伤组织培养过程中，随着愈伤 组织的迅速增生，病毒感染的程度会明显降低。
经过多次继代培养，新产生的愈伤组织的分散 程度增加，染病的几率会越来越小，从愈伤组织诱 导生产的试管苗，就会得到脱毒的再生植株。 原因：①细胞的增殖速度快于病毒复制的速度； ②细胞产生变异，获得对病毒感染的抗 性，最终表现出脱毒现象。
酶联免疫吸附反应鉴定法（ELISA） ELISA是采用酶标记的抗体来指示抗原抗体结合的微量测定法。 ①将抗体固定在支持物上， ②加入被检测的植物提取液， ③然后加酶（某种过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体， ④最后加入该种酶反应底物。
如果试样存在病毒（抗 原），那么抗原和抗体 就会结合，这样加入的 酶反应底物就会被标记 在抗体上的酶分解，根 据反应溶液的色泽的变 化进行定性或定量分析。 用分光光度计鉴定，灵 敏度极高。这一方法在 检测大量样本时特别实 用。

2、热处理脱毒的原理：
热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的耐热性的差异。
GA和黄化处理也有一定效果
热处理和茎尖培养获得无病毒植株
Thermotherapy and Tissue Culture Procedures for Obtaining Disease-free Stock Plants
五、无病毒植株的快繁与保存
培养快繁 得到脱毒无性系，即可继代繁殖。或低温保存。 无毒种苗繁殖 为了生产需要，获得无毒种苗应在大田进行扩繁。因为脱 毒苗并不具备额外抗病能力，即在大田生长中有可能重新 感病。 无虫网室扩繁种苗（马铃薯）。 选择隔离区，无病原地带。

脱毒种苗的繁殖 脱毒苗→原原种→原种（一级、二级）→种苗（种薯） （一级、二级） 防虫网室 良好隔离条件 温室
马铃薯茎尖分生组织培养
2、在茎尖培养中影响脱毒的因素
1）培养基： 营养成分： MS培养基，K+ NH4+含量 生长调节剂：少量的生长素（NAA,IAA)、细胞分裂素 （6-BA）、GA3 2）外植体的大小：决定存活率的大小 三个因素：根除病毒、可以发育为完整植株的能力、带 有叶原基。 3）培养条件：光照4000lx（照光比暗培养效果好，但对于 易褐化的材料需一段暗培养） 温度：25±2℃（低温会使茎尖休眠，不利于萌发）。
(A) RT-PCR of sweetpotato samples after thermotherapy and meristem tip culture. Positive control (I), one kb plus molecular weight marker, invitrogen, USA (M) and reformed sweetpotato plants (1-6).
二、植物组织中病毒的分布
病毒在植物组织中分布不均匀：在顶端分生组织中含毒少， 在老组织中病毒增加。（茎尖培养脱毒的理论依据） 植物茎尖分生组织无病毒原理（原因）： (1) 能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消 耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合 成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植 物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从 而就抑制了病毒核酸的复制。 (2) 传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现 的，但在茎尖分生组织中，维管组织还不健全或不存在， 从而抑制了病毒向分生组织的传导。
（五）珠心胚培养脱毒
珠心组织与维管束没有联系，故可以培养珠心组织得到无病 毒植株。 如柑橘类多胚品种中除一个受精胚外，尚有多个有珠心细胞 形成的无性胚，称为珠心胚。 珠心胚与维管束系统无联系，因此由此产生的植株全部为无 病毒的植株。
六、化学疗法：
在培养基中加入一定浓度的2-硫脲嘧啶，可消除烟草组织 中的PVY病毒。病毒抑制剂：2，4-D、碱性孔雀绿等。
植物组织的脱毒培养
一、植物病毒的危害
病毒: 一类结构简单生物，由核酸和蛋白质分子组成。病毒结构 简单，没有完整的酶系统来独立地进行物质代谢和能量代 谢，只能依靠寄主生物的酶系统实现生理代谢过程，因此， 具有寄生性。 病毒侵入寄主后，在寄主细胞中进行自我复制而迅速增殖， 并扩展到植物全株发病。 病毒病不同于真菌和细菌病害，不能用杀菌剂和抗菌素进 行防治，与细胞共生，一旦染病，只能采用拨除病株的措 施。
四、无病毒植株的鉴定
1 直接测定法：形态、症状 2 指示植物法 指示植物：接种后某种病毒能迅速表现典型或特有症状的 植物。 如：千日红、苋色藜、灰藜等植物。病毒可以在指示 寄主植物上产生典型或特异的病毒病症状，利用这一原理， 将待测植物的汁液接种到寄主植物上，根据侵染与否以及 侵染程度来确定脱毒效果。 例如：PVX感染千日红植物后，表现红色环状斑纹。SwPLV 感染苋色藜后出现枯斑。
感病植物 热处理 茎尖分生组织培养 再生植株 脱毒种苗的繁殖
病毒检测
病毒检测
增殖扩繁
脱毒苗保存
生根培养
炼苗移栽
植物脱毒培养的基本程序