高三生物一轮复习优质学案：考点加强课6 限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定

1．限制酶的选择原则

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco R Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。

（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结

构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pstⅠ因其会破坏标记基因而不宜选择。

③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶

若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）

2．目的基因的检测与鉴定

（1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：①载体上标记基因的标记原理

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含

该载体，原理如下图所示：

②“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？

经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。

（2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。

（3）采用“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。（4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。

『例证』（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经Bam HⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的

产物连接，理由是_______________________________________________

_______________________________________________________________。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有，不能表达的原因是

______________________________________________________________。

图（c）

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有

和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________________________________________________________。[慧眼识图获取信息]

（1）三种限制酶切割结果分析

（2）表达载体与重组DNA分子分析

『答案』（1）Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（3）E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA 连接酶

1．（2019·湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Amp r表示氨苄青霉素抗性基因，Tet r表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：

（1）过程①所用到的组织细胞是，过程④所用的酶是。⑤过程常用溶液处理大肠杆菌。

（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为。

（3）如果用限制酶PstⅠ、Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类（填“相同”或“不同”），这些种类的DNA 片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有种和种。

（4）如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含Amp r、Tet r），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙