亲和层析纯化重组蛋白

亲和层析纯化重组蛋白

【实验目的】

学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白。

【实验原理】

利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性,(Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-

末端融合了His-tag,则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将

其纯化,经过低浓度咪唑溶液洗涤后,可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE

法进行检测。

【器材与试剂】

1.实验仪器摇床,高速冷冻离心机,超声波细胞破碎仪,微量移液器,电泳仪,蛋白电泳槽

2.实验试剂蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2,镍离子螯合树脂(His.Bind Resin,美国Novagen公司),结合缓冲溶液:0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,20 mmol/L

Tris-Cl,pH8.0;洗涤缓冲液: 0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,20 m mol/L Tris-Cl,pH8.0;洗脱缓冲液:0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑,20 mmol/L Tris-

Cl,pH8.0;30%凝胶贮液:29% 丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10% 十二烷基硫酸钠(SDS),N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED), 10%过硫酸铵,标准分子量蛋

白,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1% SDS,pH8.3;1.5

mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50

mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS, 10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸

3.实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)(工程菌)

【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)

1.取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内,待凝胶沉淀且保护剂流净后,用10 mL蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液,待其流干净后,用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。

2.接种工程菌于20 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基

中,37℃,振荡培养(250 r/min)过夜。

3.将过夜培养物转接到500 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养

基中,37℃,振荡培养(250 r/min)3 h,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养

4h。

4. 培养物在4℃,5 000×g离心10 min,收集菌体。

5.菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中,冰浴条件下用超声波破碎细胞15次(800W,工作时间10 s,间隔时间60 s)。

6.细胞裂解液于4℃,12 000×g离心30 min,取上清液,保留50 μL以备电

泳分析。

7.将其余上清液加到层析柱内,让其自然流过层析介质。

8.先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱,再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。

9.用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,收集洗脱液。

10.分别取10 μL细胞裂解液、洗脱液与10 μL蛋白载样缓冲液(2×)混合,煮沸5 min, SDS-PAGE分析,观察纯化效果。

【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装。)层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂,以免将树脂上的Ni2+洗掉,导致无法纯化出蛋白