实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化
实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化
实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.了解葡聚糖凝胶SephadexG-25分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.二、实验原理据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的8种氨基酸。
本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。
盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关。
分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。
改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。
脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。
G-25:1000---5000；G-50:1500---30000；G-75:3000---80000 三、实验用品仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-25饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70-80℃水温中搅拌溶解。
将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
四、实验步骤1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离取卵清2mL于试管中；加2mL的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置2分钟；3000r/min,离心5分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。
取上清液，加入固体硫酸铵（计算4mL溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g）；3000r/min，离心5分钟；沉淀为卵清白蛋白(M43000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。
球蛋白纯化实验报告
一、实验目的1. 学习球蛋白的分离和纯化技术；2. 掌握盐析法、凝胶层析法等纯化方法；3. 熟悉球蛋白纯度的鉴定方法。
二、实验原理球蛋白是血清中的一种重要蛋白质，其含量约占血清总蛋白的16%。
由于球蛋白与其他蛋白质在分子量、溶解度、带电荷等方面存在差异，因此可以通过盐析法、凝胶层析法等方法进行分离和纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清、硫酸铵、Sephadex G-25凝胶、醋酸纤维素薄膜、电泳缓冲液等；2. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶层析柱、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 球蛋白粗提（1）取一定量的血清，加入适量的硫酸铵，搅拌均匀；（2）静置一段时间，使球蛋白沉淀；（3）离心分离，收集沉淀；（4）将沉淀溶解于适量的去离子水中，得到球蛋白粗制品。
2. 球蛋白纯化（1）将球蛋白粗制品加入适量的Sephadex G-25凝胶柱中；（2）用去离子水进行洗脱，收集洗脱液；（3）用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，确定最佳洗脱条件。
3. 球蛋白纯度鉴定（1）取适量纯化后的球蛋白，进行醋酸纤维素薄膜电泳；（2）用标准蛋白质分子量对照，观察球蛋白的电泳图谱；（3）根据电泳图谱，判断球蛋白的纯度。
五、实验结果与分析1. 球蛋白粗提实验结果显示，通过盐析法从血清中成功提取了球蛋白，沉淀量约为1.2g。
2. 球蛋白纯化实验结果表明，通过凝胶层析法成功纯化了球蛋白，蛋白质纯度达到90%以上。
3. 球蛋白纯度鉴定通过醋酸纤维素薄膜电泳，观察到纯化后的球蛋白在相应位置呈现出明显的条带，与标准蛋白质分子量对照一致，说明球蛋白纯度较高。
六、实验结论1. 本实验成功从血清中提取了球蛋白，并通过盐析法、凝胶层析法等方法进行了纯化；2. 纯化后的球蛋白纯度较高，可用于进一步的研究和应用。
七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的球蛋白粗提方法，但纯度较低；2. 凝胶层析法是一种高效、简便的球蛋白纯化方法，但操作较为复杂；3. 醋酸纤维素薄膜电泳法是一种常用的球蛋白纯度鉴定方法，操作简便，结果准确。
实验设计：卵清蛋白
实验注意事项
1 2 3
蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉，分离效果不好。 • 蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率较低。一 般蛋白质浓度在2.5%～3.0%较适中。
蛋白质提取过程中须注意温度的控制，一般在20℃ 以下进行
调节等电点一定要准确，在本实验中，球蛋白和卵 清蛋白的等电点相差较小，若不准确，会导致蛋白 质不纯。
9 提取液
1.0 3.0
0 4.0 0
0.5 3.5 0.125
1.0 3.0 0.25
1.5 2.5 0.375
2.0 2.0 0.50
2.5 1.5 0.625
3.0 1.0 0.75
4.0 0 1.0
实验步骤
（二）蛋白提取液中蛋白质含量测定 1、提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质 溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测 蛋白质的浓度。 排除干扰：将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的 吸收差求出蛋白质浓度。 2.计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260 （式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下 测得的光吸收值）
.
弃上清液
实验步骤
二.卵清蛋白活性测定：
（一）紫外吸收法测定卵清蛋白的含量 1、标准曲线法 （1）标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各 管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
试管号 试剂 标准蛋白溶液 /mL 蒸馏水/mL 蛋白质浓度 /mg/mL A280 1 2 3 4 5 6 7 8
从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法
从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法
1卵类黏蛋白
卵类黏蛋白是一类可以在动物卵液中发现的蛋白质。
它们可以将鸡胚募集到一起，增强鸡蛋的结构稳定性，并提供保护。
一般而言，卵类黏蛋白的结构和特性决定着卵的物理机能性。
2从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白
从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的常见方法是复合膜离心法。
根据有机化合物数量不同，可采取不同的柱装置进行构建有机化合物，包括反相层析柱、正相层析柱、活性柱和离子交换柱。
事先采用离心法将鸡蛋清分离出来，得到洁净的蛋清液；然后使用复合膜离心法将卵类黏蛋白从洁净的蛋清中纯化出来。
3复合膜离心法的利用
复合膜离心法可将卵类黏蛋白从洁净的蛋清液中快速分离出来，具有较高的效率和稳定性。
它主要包括两个步骤：沉淀膜分离与浓缩离心分离。
首先，有机溶液中的粒子和蛋白质被沉淀膜分离出来；然后，经过浓缩离心分离，可快速净化出洁净的卵类黏蛋白。
此外，通过可调节的pH值，正确地控制溶液的离子强度，可有效提取卵类黏蛋白。
4结论
从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的最佳方法是采用复合膜离心法，该方法具有较高的效率和稳定性。
通过正确控制pH值和溶液离子强度，还可以有效地提取卵类黏蛋白。
因此，复合膜离心法应该成为从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的理想方法。
从蛋清中提取卵清蛋白的原理
从蛋清中提取卵清蛋白的原理
卵清蛋白是一种高分子蛋白质，具有多种生物活性和营养价值。
提取卵清蛋白主要是通过分离蛋白质的不同成分，将卵清蛋白分离出来。
以下是从蛋清中提取卵清蛋白的原理及操作步骤。
首先，将新鲜的鸡蛋打开，将蛋黄和蛋壳分离，只留下蛋清。
将
蛋清放入容器中，加入一定量的盐酸或硫酸，这样蛋清中的蛋白质会
被“变性”，聚集成块。
接下来，用离心机将蛋清离心，然后将上层液体去除，留下粘稠
的液态凝胶。
加入一定量的盐水，搅拌均匀后，用滤纸或过滤器过滤，把精细的卵清蛋白分离出来。
卵清蛋白提取的关键在于掌握好加入酸性物质的量和时间控制。
在不断调试的过程中，可以找到较佳的提取卵清蛋白的条件，从而提
高提取效率。
卵清蛋白是营养高、易消化的蛋白质，广泛应用于食品和医疗行业，如制作饮料、糕点、乳制品和药品等。
因此，了解卵清蛋白的提
取原理，可以帮助我们更好地利用蛋白质资源，为生活健康和疾病防
治做出贡献。
卵清蛋白质实验报告
一、实验目的1. 了解卵清蛋白质的组成、结构和功能性质。
2. 掌握卵清蛋白质的提取、分离和纯化方法。
3. 学习蛋白质功能性质的检测方法。
二、实验原理卵清蛋白质是鸡蛋中的一种重要蛋白质，占鸡蛋蛋白质总量的60%左右。
卵清蛋白质具有丰富的氨基酸组成，营养价值高，是食品、医药和生物工程等领域的重要原料。
本实验主要研究卵清蛋白质的提取、分离、纯化和功能性质。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、硫酸铵、氯化钠、NaOH、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯乙酸、硫酸铜、酚酞指示剂等。
2. 仪器：离心机、冰箱、电子天平、pH计、电泳仪、紫外分光光度计、离心管、烧杯、移液器等。
四、实验步骤1. 卵清蛋白质的提取（1）将新鲜鸡蛋洗净，去壳取卵清。
（2）将卵清用玻璃棒搅拌均匀，加入适量硫酸铵，搅拌至蛋白质析出。
（3）将混合液离心（3000r/min，10min），收集沉淀。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次，弃去上清液。
（5）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，得到卵清蛋白质溶液。
2. 卵清蛋白质的分离（1）将卵清蛋白质溶液用pH计测定pH值，调节至7.0。
（2）加入适量氯化钠，搅拌至蛋白质析出。
（3）将混合液离心（3000r/min，10min），收集沉淀。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次，弃去上清液。
（5）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，得到分离后的卵清蛋白质溶液。
3. 卵清蛋白质的纯化（1）将分离后的卵清蛋白质溶液用NaOH调节pH值至8.0。
（2）加入适量乙醇，搅拌至蛋白质析出。
（3）将混合液离心（3000r/min，10min），收集沉淀。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次，弃去上清液。
（5）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，得到纯化后的卵清蛋白质溶液。
4. 卵清蛋白质的功能性质检测（1）吸水性：将纯化后的卵清蛋白质溶液滴在滤纸上，观察滤纸吸水情况。
（2）溶解性：将纯化后的卵清蛋白质溶液滴入蒸馏水中，观察溶解情况。
蛋清卵类粘蛋白的分离纯化
蛋清卵类粘蛋白的分离纯化一．实验器材1.仪器：pH计、恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器、层析柱、紫外可见光分光光度计、真空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析袋、冷冻离心机、真空干燥箱、分析天平2.试剂：新鲜鸡蛋、Sephadex G-25凝胶填料、DEAE-32纤维素离子交换填料、卵类粘蛋白标品、三氯乙酸(TCA)、丙酮、氯化钠、NaH2P04、Na2HP04、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、Tris-base、十二烧基硫酸钠、乙醇、冰醋酸、碳酸氧钠、氯化铁、硫酸胺3.主要溶液的配制及材料的处理：10%三氯醋酸(pH 1.15):先把称好的TCA加总体积2/3的水溶解,再用10 mol/LNaOH调节pH至1.15,最后加水至所需体积。
0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液: 先配成10倍的母液,用时稀释至0.02 mol/L;磷酸氧二钠-磷酸二氧钠缓冲液(0.02 mol/L, pH 6.5, 25℃）配制方法:0.2 mol/L 磷酸氢二钠:Na2HP04 12H20 71.64 g/1000 mL, 31.5 mL;0.2 mol/L 磷酸二氧钠:NaH2P04 2H20 31.21 g/1000 mL, 68.5 mL;胰蛋白酶标准液(0.5mg/mL):用0.001 mol/LHCl配制(每次50ml,用完再配);BAEE 底物缓冲液(内含0.05 mol/L CaCb): 用0.05 mol/L 的Tris-HCl 溶解,调pH至7.8;1 mmol/L BAEE底物溶液: 34 mg BAEE定容至100 mL底物缓冲液中,临用前配置。
Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析填料的处理: 称取30 g Sephadex G-25,用0.02mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液500 mL热溶胀2 h或者室温溶胀24 h。
从鸡蛋清中提取蛋白质大孔吸附树脂实验报告
从鸡蛋清中提取蛋白质大孔吸附树脂实验报告一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法，主要采用盐析沉淀结合树脂吸附的方法一次从蛋清中分离出卵黏蛋白、卵转铁蛋白、卵白蛋白、卵抑制剂、卵类黏蛋白以及溶菌酶共六种蛋白，该方法工艺简单，提取周期短，不仅避免了有毒试剂残留问题，同时大大提高了生产效率，易于实现工业化。
本发明大大提高了蛋品加工的附加值，产生了显著的经济效益和社会效益。
1.一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取溶菌酶：取鸡蛋蛋清3000mL，加入蒸馏水，调节pH，加入树脂，搅拌、静置、离心，得到第一沉淀物和第一上清液，将第一沉淀物使用蒸馏水和缓冲液冲洗、洗脱液洗脱、离心，得到溶菌酶；（2）提取卵黏蛋白：取步骤（1）所述第一上清液，加入氯化钙溶液，调节pH，离心，得到第二沉淀物和第二上清液，取所述第二沉淀物，加入蒸馏水，匀质，调节pH，离心，得到卵黏蛋白；（3）提取卵转铁蛋白：取步骤（2）所述第二上清液，加入硫酸铵和柠檬酸，第一次调节pH，静置、离心，得到第三沉淀物和第三上清液，取所述第三沉淀物，加至十二烷基硫酸钠溶液中，离心得到第四沉淀物和第四上清液，将所述第四沉淀物倒入蒸馏水中，第二次调节pH、静置、第三次调节pH，离心，得到卵转铁蛋白，所述十二烷基硫酸钠溶液的物质的量为1-30mmol，体积为800-1200mL；（4）提取卵类黏蛋白：取步骤（3）所述第三上清液和第四上清液，加入硫酸铵，静置、离心，得到第五上清液，加热所述第五上清液，离心，取上清液即第六上清液，加入无水乙醇、离心，得到第五沉淀物和卵类黏蛋白，所述加热温度为50-70℃；（5）提取卵白蛋白：取步骤（4）所述第五沉淀物，加入蒸馏水，调节pH，离心，得到卵白蛋白和第七上清液；（6）提取卵抑制剂：取步骤（5）所述第七上清液，浓缩脱盐，调节pH，加入硫酸铵溶液，搅拌、离心，得到上清液为卵类黏蛋白，得到沉淀物为卵抑制剂；步骤（1）所述调节pH值为9.0-9.5；步骤（2）所述调节pH值为6.0；步骤（3）所述第一次调节pH值为4.5，所述第二次调节pH值为8.0-10.0，所述第三次调节pH值为4.0-6.0；步骤（5）所述调节pH值为7.0；步骤（6）所述调节pH值为4.0.2.根据权利要求1所述的鸡蛋清中蛋白质的提取方法，其特征在于，步骤（1）所述蛋清、蒸馏水和树脂比例为50mL：50mL：5-20g。
最新实验设计：卵清蛋白
❖ 蛋白质分子表面含有带电荷基团，这些基团与水分子有较大 的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白 质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐， 导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起 蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。
管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
试管号 试剂
1
2
3
4
5
6
7
8
9 提取液
标准蛋白溶液
/mL
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 1.0
蒸馏水/mL
蛋白质浓度 /mg/mL
4.0
3.5
3.0
2.5 2.0 1.5 1.0 0
3.0
0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0
实验设计：卵清蛋白
Contents
实验目的 实验原理 实验方法 实验材料及用品 实验步骤 实验注意事项
实验目的
1.掌握提取鸡蛋清中卵清蛋白的基本原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用方法及注意事项。 3.掌握用紫外吸收法测定蛋白质活性，了解其他测 定蛋白质活性的方法。
实验原理
❖ 一、沉淀法粗分离蛋白质
❖ 由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它 们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白 质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐 的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到 粗分离蛋白质的目的。
实验原理
❖ 鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在 半饱和硫酸铵溶液中析出，而卵清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才 能析出。
实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定
实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定一、实验目的和要求1）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。
2）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。
3）了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。
4）掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。
5）学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。
二、器材和试剂1．实验器材：层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒；2．实验试剂：(1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L 氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol ／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银三、实验原理1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。
2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质:鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定一、实验目的1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法5.学习柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。
（一）粗提原理-盐析法1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
2.水化膜减弱、消失。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
3.蛋白质表面的电荷大量被中和。
中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。
（二）脱盐原理-凝胶层析1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。
2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。
（三）纯化原理-离子交换层析离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
（四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法：（一）实验材料1.样品：人混合血清2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等（二）实验方法1.实验步骤2.注意事项✓上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。
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实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化
一、实验目的
了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.
了解葡聚糖凝胶SephadexG-25分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.
二、实验原理
据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的8种氨基酸。
本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。
盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关。
分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。
改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。
脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。
G-25:1000---5000；G-50:1500---30000；G-75:3000---80000 三、实验用品
仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置
器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱
药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-25
饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70-80℃水温中搅拌溶解。
将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
四、实验步骤
1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离
取卵清2mL于试管中；加2mL的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置2分钟；3000r/min,离心5分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。
取上清液，加入固体硫酸铵（计算4mL溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g）；3000r/min，离心5分钟；沉淀为卵清白蛋白(M43000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。
2、凝胶柱层析（重点讲解，不安排做试验）
(1) 凝胶柱的准备：sephadexG-25沸水溶胀30分钟，倾泻法倾去悬浮的小颗粒，湿装法装柱。
(2) 加样和洗脱：先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚与凝胶表面相切，用枪吸取1mL样液沿着管壁加入柱子上方，再加3mL蒸馏水，开始脱盐，每管收集2mL共15管。
(3)收集和测定：280nm紫外吸收测定蛋白质含量或者用考马斯亮蓝法在在595nm波长测吸光度值。
(4)以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线，将蛋白质溶液收集待用。
（5）将每管的洗脱液取出1ml，加入几滴BaCl2溶液，观察是否有沉淀，以此判断脱盐是否完全。
五、数据结果与分析
（1）数据记录与分析
（2）绘制洗脱曲线
06121824303642485460 00.0110.7670.4680.2430.040.0570.0240.0690.0170.053。