实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化
一、实验目的
了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.
了解葡聚糖凝胶SephadexG-25分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.
二、实验原理
据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8克,主要为卵白蛋白和卵球蛋白,还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等,其中含有人体必需的8种氨基酸。
本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。
盐析的原理:蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影响下脱去水化层,同时,蛋白质分子所带的电荷被中和,结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关。
分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。
改变盐浓度,使不同分子量的蛋白质分别析出。
脱盐的原理:含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时,小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中,向下移动的速度较慢;而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔,以较快的速度流过凝胶柱,从而使蛋白质与盐分开。
G-25:1000---5000;G-50:1500---30000;G-75:3000---80000 三、实验用品
仪器:752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置
器皿:5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱
药品及材料:新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-25
饱和硫酸铵溶液:称固体硫酸铵(分析纯)850g,置于1000ml蒸馏水中,在70-80℃水温中搅拌溶解。
将酸度调节至pH7.2,室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵溶液。
四、实验步骤
1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离
取卵清2mL于试管中;加2mL的半饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀,静置2分钟;3000r/min,离心5分钟;沉淀为卵球蛋白(M130000),加蒸馏水定容至4mL溶液。
取上清液,加入固体硫酸铵(计算4mL溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g);3000r/min,离心5分钟;沉淀为卵清白蛋白(M43000),加蒸馏水定容至4mL溶液。
2、凝胶柱层析(重点讲解,不安排做试验)
(1) 凝胶柱的准备:sephadexG-25沸水溶胀30分钟,倾泻法倾去悬浮的小颗粒,湿装法装柱。
(2) 加样和洗脱:先将柱内液体用滴管轻轻吸去,使液面下降到刚与凝胶表面相切,用枪吸取1mL样液沿着管壁加入柱子上方,再加3mL蒸馏水,开始脱盐,每管收集2mL共15管。
(3)收集和测定:280nm紫外吸收测定蛋白质含量或者用考马斯亮蓝法在在595nm波长测吸光度值。
(4)以洗脱体积为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线,将蛋白质溶液收集待用。
(5)将每管的洗脱液取出1ml,加入几滴BaCl2溶液,观察是否有沉淀,以此判断脱盐是否完全。
五、数据结果与分析
(1)数据记录与分析
(2)绘制洗脱曲线
06121824303642485460 00.0110.7670.4680.2430.040.0570.0240.0690.0170.053。