流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量检测方法验证方案新

封面

长春生物制品研究所有限责任公司

Changchun Institute of Biological Products Co.,Ltd.

1.目的Objective：

本验证方案的目的是为了评价流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量测定的专属性，线形，准确性、重复性和中间精密度参数，以满足流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量测定的检测要求。验证的检测结果将按照该验证方案进行记录。

2.范围Scope：

本次验证针对流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量测定的方法学验证，检测流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量测定方法的专属性，线形，准确性、重复性和中间精密度。

4. 术语和定义 Terms and definitions：

在下面的表格中规定了本方案中使用的缩略语。

5.法规和指南 Regulations and guidelines:

EudraLex-卷4 GMP指南

(SFDA) GMP(2010年修订版)

药品生产验证指南（现行版）

中国药典（2015版）三部

6.方法验证策略描述 :

6.1 方法描述

流感病毒裂解疫苗的卵清蛋白含量测定采用酶联免疫定量检测法检定。抗体结合到某种固相载体表面，保持其免疫活性，并且抗体与某种酶连接成酶标抗体，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗原）和酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。试剂盒中酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度

在450nm处测得吸光度值，用标准品做标准直线计算出流感病毒裂解疫苗的卵清蛋白含量。

6.2 方法特点

6.2.1试剂盒：

卵清蛋白酶联免疫定量检测试剂盒

6.2.2试剂盒内容物

96孔板，洗液（10×），样品稀释液，卵清蛋白标准品1（20.0ng/ml），卵清蛋白标准

品2（10.0ng/ml），卵清蛋白标准品3（5.0ng/ml），卵清蛋白标准品4（2.5ng/ml），卵清蛋白标准品5（1.25ng/ml），卵清蛋白标准品6(0.625ng/ml），卵清蛋白标准品7（0.31ng/ml），卵清蛋白阳性对照，酶标抗体，底物工作液。终止液。

6.2.3 用卵清蛋白酶联免疫定量检测试剂盒检测到参数应满足如下条件，才能视试验结果有效

6.3 方法验证策略

6.3.1专属性，准确度的验证

根据中国药典（2015版）三部，流感病毒裂解疫苗成品卵清蛋白含量应不高于500 ng/ml，根据长春生物制品研究所流感裂解疫苗成品内控质量标准，卵清蛋白含量应不高于100 ng/ml，鉴于长春生物制品研究所流感裂解疫苗历年成品卵清蛋白含量不高于50 ng/ml和卵清蛋白酶联免疫定量检测试剂盒中最大标准品浓度为20 ng/ml,在最终4倍稀释样品背景下卵清蛋白的目标浓度为12.5 ng/ml,,因此,用下表中所列的样品背景中浓度级卵清蛋白溶液来进行专属性、准确性的验证。

6.3.2 重复性，中间精密度的验证

6.3.2.1重复性验证方法：取流感病毒裂解疫苗1批，同一分析人员分别取6次样品，在同一标准曲线下分别测定6次。按《流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量检测标准操作规程》

SI-05-003进行操作，计算样品的平均值、SD、变异系数（CV%）。

6.3.2.２中间精密度的验证方法

取上述流感病毒裂解疫苗同一批，由另一分析人员在同一实验室，不同时间，用同一设备分别取6次样品，在同一标准曲线下分别测定6次。按《流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量检测标准操作规程》SI-05-003进行操作，计算样品平均值、SD、变异系数（CV%）。

6.3.3 线形的验证

在准确度，重复性和中间精密度测试中，标准曲线的R值大于0.99即验证该方法的线性符合要求。

7.风险评估

7.1目的：对各验证项目的重要性和可操作性进行评价，以确定此次验证方案是否实施该验证项目。

7.2此次验证的流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量检测为药典中提到的酶联免疫法,按照GMP 中定量检定方法的相关规定以部分验证形式对以下验证项目进行评估及执行。

8.验证方案执行

7.1验证前的检查

7.1.1对验证人员基本资料进行确认，将确认结果记录至“测试表 1 人员确认”。

7.1.2对验证相关文件进行验证，文件应齐全且为现行文件。将验证结果记录至“测试表 2文件确认”。

7.1.3验证仪器应经校验合格后使用，并且在校验有效期内，确认结果记录至“测试表 3 仪器设备确认”。

7.1.4验证使用的试剂及原料等已得到有效的确认，确认结果符合企业内控标准。确认结果记录至“测试表 4 试剂确认”。

7.2检验方法要求

要求每次验证操作每一环节都要与实际操作相一致。

7.3材料设备

7.3.1材料

（1）20～200µl单道微量可调移液器及配套吸头，50～300µl多道微量可调移液器及配套吸头

（2）50ml烧杯

（3） 100ml量筒

7.3.2设备

（1）生化培养箱

（2）酶标仪（带450nm滤光片）

7.3.3试剂

7.3.4检测样品

7.4验证项目

7.4.1准确度

7.4.1．1准确度:准确度系指采用该方法测测得的结果与真实值或参考值接近的程度,一般用回收率(%)表示。

7.4.1．2方法：取流感病毒裂解疫苗1批，由一分析人员测试。样品稀释4倍用作工作背景样品液，将卵清蛋白酶联免疫定量检测试剂盒中的20.0 ng/ml卵清蛋白标准品用工作背景样品液稀释成3个浓度(15.0ng/ml，12.5ng/ml，10.0ng/ml)，作为样品回收液。按《流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量检测标准操作规程》SI-05-003进行操作，测定3次。计算样品的回收率(%)。测试结果见测试表 5准确性确认和测试表6卵白准确性记录

7.4.1.3可接受标准：回收率80-120%。

7.4.1.4回收率计算公式:测量浓度 / 理论浓度 x 100%

7.4.2专属性

7.4.2.1专属性：专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能正确测定被测物的能力。不

7.4．2.2 方法：取流感病毒裂解疫苗1批，由一分析人员测试。取用作工作背景的4倍样品稀释液和卵清蛋白酶联免疫定量检测试剂盒中的稀释液(0ng/ml)，测OD值，计算回收率（%）。测试结果见测试表 7专属性确认

7.4.2.3可接受标准：回收率95.0-105.0%。

7.4.2.4回收率计算公式:测量浓度 / 理论浓度 x 100%

7.4.2精密度

7.4.2.1重复性：在相同条件下，由同一分析人员测得结果的精密度为重复性。

7.4.2.1.1方法：取流感病毒裂解疫苗1批，同一分析人员测得结果的精密度,分别测定6次，按《流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量检测标准操作规程》SI-05-003进行操作，计算样品的平均值、SD、变异系数（CV%）。测试结果见测试表 8重复性确认和测试表9卵白重复性记录

7.4.2.1.2可接受标准：变异系数＜10%。

7.4.2.2中间精密度：在同一实验室，不同时间由不同分析人员用同一设备测得的精密度为中间精密度。

7.4.2.2.1方法：取流感病毒裂解疫苗1批，由另一分析人员测得结果的精密度,分别测定