兔(Rabbit)卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)-NEWA
兔子血清抗体实验报告
一、实验目的1. 探究兔子血清中抗体的产生及其特异性。
2. 分析兔子血清抗体与其他动物血清抗体的交叉反应性。
二、实验原理1. 兔子血清抗体实验基于抗原-抗体特异性结合原理。
将抗原物质注入兔子体内，兔子体内产生针对该抗原的特异性抗体。
2. 将兔子血清抗体与不同动物的血清进行混合，观察沉淀反应，分析抗体特异性及交叉反应性。
三、实验材料1. 实验动物：兔子（体重约2.5kg）2. 实验试剂：抗原（如卵蛋白）、兔抗人血清抗体、人血清、黑猩猩血清、狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清3. 实验器材：注射器、离心机、移液器、培养皿、显微镜等四、实验方法1. 兔子血清抗体制备（1）将抗原（如卵蛋白）注入兔子体内，免疫兔子。
（2）免疫后一周，采集兔子血液，分离血清。
（3）用ELISA法检测兔子血清抗体滴度，确定抗体产生。
2. 抗体特异性及交叉反应性分析（1）将兔子血清抗体与不同动物的血清进行混合，如人血清、黑猩猩血清、狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清。
（2）观察混合液是否产生沉淀反应，分析抗体特异性及交叉反应性。
五、实验结果1. 兔子血清抗体制备（1）免疫后一周，采集兔子血液，分离血清。
（2）ELISA法检测兔子血清抗体滴度，抗体滴度为1:32000。
2. 抗体特异性及交叉反应性分析（1）将兔子血清抗体与人血清混合，产生沉淀反应。
（2）将兔子血清抗体与黑猩猩血清混合，产生轻微沉淀反应。
（3）将兔子血清抗体与狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清混合，未产生沉淀反应。
六、实验讨论1. 兔子血清抗体实验成功制备了针对抗原的特异性抗体，表明兔子体内能够产生针对特定抗原的免疫反应。
2. 兔子血清抗体与人血清产生沉淀反应，表明兔子血清抗体具有特异性，可以识别并结合人血清中的抗原。
3. 兔子血清抗体与黑猩猩血清产生轻微沉淀反应，表明兔子血清抗体具有一定的交叉反应性，但与狒狒血清、蜘蛛猴血清、猪血清、羊血清无交叉反应，说明抗体特异性较高。
抗人T细胞兔免疫球蛋白
抗人T细胞兔免疫球蛋白Kang Ren T Xibao Tu MianyiqiudanbaiAnti-human T Lymphocyte Rabbit Immunoglobulin本品系由人T淋巴细胞免疫家兔后,取其血清或血浆经去除杂抗体、纯化、浓缩后,再经病毒灭活处理并加入适宜稳定剂后冻干制成。
不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 免疫血清2.1.1 免疫抗原免疫用抗原为人胸腺细胞,或符合“血液制品生产用人血浆”中供血浆者标准的健康人血液分离的人淋巴细胞。
胸腺供体为HBsAg、HCV抗体、HIV-1/HIV-2抗体和梅毒血清学检查应为阴性。
分离后T淋巴细胞数应不低于总细胞数的90%,红细胞数应不高于总细胞数的5%。
2.1.2 免疫动物免疫用家兔至少应符合普通级实验动物的要求(附录ⅩⅢ B和附录ⅩⅢ C),体重为2000~2500克,检疫合格者方可使用。
2.1.3 免疫方法按批准的免疫程序免疫。
2.1.4 采血及分离血清加强免疫后,淋巴细胞毒试验效价达1∶400时即可采血。
分离的血清置-20℃以下保存。
保存期不应超过2年。
2.2 原液2.2.1 混合血清经56℃水浴30分钟灭能,辛酸-硫酸铵盐析分离纯化或经批准的其他分离纯化法,杂抗体吸收,再用DEAE-sephadex A-50色谱纯化抗人T细胞兔免疫球蛋白。
杂抗体吸收用的人红细胞、人血小板、人胎盘组织及人血浆的供给者应符合“血液制品生产用人血浆”中供血浆者标准。
2.2.2 原液检定按3.1项进行。
2.3 半成品制备2.3.1 配制加入适量麦芽糖或其他适宜稳定剂。
按成品规格以灭菌注射用水稀释至所需蛋白质浓度,并适当调整pH值及钠离子浓度。
2.3.2 半成品检定按3.2项进行。
2.4 成品制备2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
小鼠卵清蛋白特异性IgEOVAsIgE试剂盒使用方法
小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)试剂盒使用方法检测范围：96T0.8μg/ml -24μg/ml使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)水平。
用纯化的小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入OV A-sIgE，再与HRP标记的OVA-sIgE抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的OV A-sIgE呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)浓度。
试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（48μg/ml）0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
24μg/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液12μg/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液6μg/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液3μg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液1.5μg/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
兔子igg 恒定区序列
兔子igg 恒定区序列兔子IGG（Immunoglobulin G）是一种恒定区序列，也被称为抗体的IgG亚型。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，能够识别和结合到身体中的外来物质，如细菌、病毒和其他病原体，以促进其清除和破坏。
兔子IGG是兔子体内产生的主要抗体类型之一。
它在体内起着至关重要的作用，能够识别和中和病原体，以保护兔子免受感染和疾病的侵害。
兔子IGG的恒定区序列是指其抗体分子中与结构和功能相关的部分。
这个区域的序列在兔子中是固定的，不会发生变化。
兔子IGG的恒定区序列具有多个重要的特征。
首先，它能够与病原体的表面抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
这种结合可以通过多种机制来中和病原体，如阻止其进入宿主细胞、激活免疫细胞杀伤病原体或激活补体系统。
其次，兔子IGG的恒定区序列还能够与免疫细胞表面的Fc受体结合，从而激活免疫细胞，增强其杀伤病原体的能力。
兔子IGG的恒定区序列在不同的亚型中有所差异。
目前已经发现了多个兔子IGG亚型，如兔子IGG1、兔子IGG2和兔子IGG3等。
每个亚型都有其特定的结构和功能。
例如，兔子IGG1亚型通常与免疫细胞的FcγR I和FcγRIII受体结合，而兔子IGG2亚型则主要与FcγRII受体结合。
这些不同的亚型在兔子的免疫应答中发挥着不同的作用。
兔子IGG的恒定区序列还可以用于研究和应用。
由于兔子IGG具有高度的特异性和亲和力，它可以用于识别和定量其他物质，如蛋白质、激素和药物。
这种特性使得兔子IGG被广泛应用于科学研究、生物医学和生物技术领域。
例如，兔子IGG可以用于制备特异性抗体，用于检测和诊断疾病。
此外，兔子IGG还可以用于制备免疫球蛋白和抗体药物，用于治疗和预防疾病。
总结来说，兔子IGG的恒定区序列是兔子体内产生的一种重要抗体类型。
它具有多种功能，能够识别和中和病原体，保护兔子免受感染和疾病的侵害。
兔子IGG的恒定区序列还可以应用于科学研究和生物医学领域，用于诊断和治疗疾病。
普通级新西兰兔血清生化指标检测和分析
12020.03·试验研究 | Experimental research0 引言许多研究表明，动物的生化指标检测结果受到动物本身的品系、年龄、性别、营养健康状况、饲养条件以及试验时样品的采集方法、保存方式、使用的检测方法等多种因素影响[1-3]。
目前尚无实验动物血液学、血清生化指标的权威参考值，也很少有试验动物血液学、生化指标检测的专用试剂，通常都是使用检测人的血液生理、生化指标的试剂进行检测[4]。
近年，随着科学技术的不断进步及我国生物医药科学研究逐步走向国际化的趋势，血清生化指标的检测方法和仪器不断更新完善，全自动生化分析仪有操作简单、准确性高、标本用量少、消耗试剂少、测试速度快、省时省力等优点，因此，现在被广泛应用于实验动物血清生化指标的检测。
新西兰兔是生物医学实验研究中最常用的动物之一，原产于美国加利福尼亚州[5]。
因其具有繁殖力强、生长发育迅速、耳朵大血管清晰便于实验、易产生发热反应等优点已被广泛应用于生物医学的教学实验以及心血管病、内分泌、物质代谢、遗传学、药理学等试验研究领域[6]。
但是目前关于普通级新西兰兔的血清生化指标的公布数据少之又少，因此本研究通过测定同一实验中心提供的健康普通级成年新西兰兔的血清生化指标，旨在建立普通级新西兰兔血清生化指标检测方法及其参考区间，为动物实验提供基础数据。
1 材料与方法1.1 试验动物和样本血清健康的普通级成年新西兰兔，雌雄随机，体重2.5～3.0kg ，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK （渝）2017-0008；使用许可证号：SYXK （渝）2018-0003。
成年普通级新西兰兔空腹12～14 h ，静息15 min 以上，由同一人使用一次性静脉采血针，在耳中动脉穿刺，采血2～3 mL 于含促凝剂的负压管中，立即颠倒混匀8～10次，静置30 min 后离心（3 500 r/min ，5 min ），分离出血清于EP 管中待测。
兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定
兔血清白蛋白和ＩｇＧ的分离纯化与鉴定目的：以兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定实验为例，阐述了血清蛋白制备与分析的过程。
方法：使用了硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC等分离纯化鉴定蛋白质的方法。
结果：制备了兔血清白蛋白和γ－球蛋白(IgG)，测定被分离物质的相对分子量，鉴定纯化产品的均一性。
结论：该实验作为一门生物综合性大型实验，非常有利于培养学生掌握蛋白质制备与分析的综合技能。
标签：分离纯化；白蛋白；γ－球蛋白；实验血清白蛋白是人体内重要的营养物质，在血液中有重要生理功能，是血液总渗透压的主要调节物质，其浓度可以反映肝脏的功能，其水平的改变能导致一系列的病理性继发症。
血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。
此外，血清白蛋白还有重要的药用价值，注射白蛋白针剂可治疗浮肿等症。
血清球蛋白是血清蛋白质的重要组成部分，能与外来的特异性抗原起免疫反应而保护机体。
检查血清总蛋白及白、球蛋白的比值，即可了解肝脏受损害的程度。
总蛋白下降、白／球蛋白比值减少、电泳试验γ－球蛋白增加，是肝炎的常见情况。
因此，测定血清白蛋白常用于患者状态的非特异监视。
1 材料与方法1．1材料试剂与仪器1．1．1材料兔血清。
1．1．2 试剂饱和(NH4)2SO4溶液、磷酸盐缓冲液(pH6.3)、Sephadex G －25、二乙氨乙基(DEAE)纤维素、三氯醋酸、0.5mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.06mool／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.02tool/L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、SPA-Sepharose－4B、结合缓冲液(pH8.9)、缓冲液I(pH7.0的PBS)、缓冲液I(pH 3.0的PBS)、Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)、柠檬酸溶液(pH3.0)、0.9％NaCI溶液、标准血清白蛋白液、考马斯亮蓝G250等。
小鼠卵清蛋白特异性 IgE(OVA sIgE) 酶联免疫分析 试剂盒使用说明书
小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析试剂盒使用说明书产品编号：E0720m2. 血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
兔免疫血清特异性IgG的初步分离纯化的教学实验设计
【 摘要 】 目的 将血 清特 异性 Ｉ ｇ Ｇ的分 离纯化与纯度 鉴定 实验 用 于医学 院本科 实验 教 学。方法
行玻 片凝 集试 验和试管凝集试验。结果 集效价 大于分 离前。结论
性免 疫血清经硫 酸铵 盐析 ， 再通过 Ｓｐ ｅｅ ｅ ｈｄｘＧ一２ ５凝胶过 滤层析 ， 将分 离前后 的样品分 别配制成相 同蛋 白浓度 ， 分别进 玻 片凝集法分 离后 的样品凝集现 象强于分 离前 ； 管凝 集法分 离后 的样品凝 试 成功得 到初 步分 离纯化 的特 异性 ＩＧ ｇ 。实验操作较为简便 ， 结果稳定 ， 再现性好 。通过本 实
【 ｅ ｏｄ】 Ｅ ｐｒ ｅｔｅｃｉ ；ｍ ｕｅ ｅ ｍ；ｅ ｐｒｅｔｎＣｒ ａ ｇ ｐｙ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｘｅ ｍｎ ｔ ｈｎ Ｉｍ ｎ ｒ Ｇ ｌ ｅ ａｏ ｈｏ ｔ ｒ ｈ； ｉ ａ ｇ ｓｕ ｍ ｉ ｍ ｏａ
ห้องสมุดไป่ตู้
Ｓｐ ｅｅ ｅｈｄｘ系列 凝胶 为惰 性 载体 ， 常不 与物 质发 生 兔 血 清于管 中 ， 通 逐滴加 入饱 和硫 酸铵 溶液 ２０ｍ 。室 温 ． ｌ 化 学反 应 ， 且不 会 因 吸 附杂 质 造 成 层 析 柱堵 塞 ， 温 度 静置 １ ｉ， ００／ ｉ 对 ０ｒｎ ３ ０ ｒｍｎ离心 １ ｉ， ａ ０ｍ ｎ 用移液器小心吸
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豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVAsIgE)酶联免疫分析(ELISA)
豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测豚鼠血清，血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgE(OV AsIgE)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)水平。
用纯化的豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵清蛋白特异性IgE(OV A sIgE)，再与HRP标记的卵清蛋白特异性IgE(OV A sIgE)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgE(OV A sIgE)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中豚鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
羊抗兔IgG(H+L),HRP标记
羊抗兔IgG(H+L)，HRP标记产品名称：Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP，羊抗兔IgG(H+L)，HRP标记货号：4050-05规格：1.0 mL特异性：抗体识别兔子的IgG重链和轻链以及兔子IgM轻链。
来源：高效价山羊抗血清交叉作用：小鼠和人免疫球蛋白和混合血清，可能与其他物种免疫球蛋白反应。
纯化：亲和色谱法，兔IgG共价链接在琼脂糖上。
缓冲溶液成分：储存溶液50%甘油，50% PBS, pH 7.4，无添加剂（启维益成有售）。
同型对照：Goat IgG储存温度：2-8°C应用：ELISA 1-3FLISAFlow Cytometry 4-7Immunohistochemistry-Frozen Sections 8-10Immunohistochemistry-Paraffin Sections 6,11-13Immunohistochemistry-Whole Mount 14,15Immunocytochemistry 16-19Immunoblotting 20-28Separation 29参考文献：1. Maroney AC, Finn JP, Connors TJ, Durkin JT, Angeles T, Gessner G, et al. Cep-1347 (KT7515), asemisynthetic inhibitor of the mixed lineage kinase family. J Biol Chem. 2001;276:25302-8.(ELISA)2. Zhang X, He M, Cheng L, Chen Y, Zhou L, Zeng H, et al. Elevated heat shock protein 60 levelsare associated with higher risk of coronary heart disease in Chinese. Circulation.2008;118:2687-93. (ELISA)3. Jin K, Wang S, Zhang C, Xiao Y, Lu S, Huang Z. Protective antibody responses againstClostridium difficile elicited by a DNA vaccine expressing the enzymatic domain of toxin B.Hum Vaccin Immunother. 2013;9:63-73. (ELISA)4. Burger PE, Gupta R, Xiong X, Ontiveros CS, Salm SN, Moscatelli D, et al. High aldehydedehydrogenase activity: a novel functional marker of murine prostate stem/progenitor cells.Stem Cells. 2009;27:2220-8. (FC)5. Spurlock CF 3rd, Tossberg JT, Fuchs HA, Olsen NJ, Aune TM. Methotrexate increasesexpression of cell cycle checkpoint genes via JNK activation. Arthritis Rheum.2012;64:1780-9. (FC)6. Aziz M, Yang W, Matsuo S, Sharma A, Zhou M, Wang P. Upregulation of GRAIL is associatedwith impaired CD4 T cell proliferation in sepsis. J Immunol. 2014;192:2305-14. (FC, IHC-PS) 7. Boonstra MC, Tolner B, Schaafsma BE, Boogerd LS, Prevoo HA, Bhavsar G, et al. Preclinicalevaluation of a novel CEA-targeting near-infrared fluorescent tracer delineating colorectal and pancreatic tumors. Int J Cancer. 2015;137:1910-20. (FC)8. Borrego L, Maynard B, Peterson EA, George T, Iglesias L, Peters MS, et al. Deposition ofeosinophil granule proteins precedes blister formation in bullous pemphigoid. Comparison with neutrophil and mast cell granule proteins. 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兔抗鸡IgG荧光抗体的制备及应用
Ｈ ｉｒ 箱 Ｂ Ｄ １６ ， 净 工 作 台 （ 州 净 化 ａ 冰 ｅ Ｃ 一９Ｆ超 苏 设 备公 司 ）Ｔ Ｌ １ Ｃ台式高 速 离心 机 （ ，Ｇ 一６ 金坛 市 医疗 仪器 厂 制造 ）Ｈ ， Ｊ控 温磁 力 搅 拌 器 （ 苏 医疗 仪 器 江
毒、 菌、 细 立克 次体 、 生 动物 及 真菌 以及抗 各 种微 原 生 物抗 体 的检 测 。近 年来 ， 疫荧 光 技 术在 兽 医科 免 学 上 的应用 比较普 遍 ， 别是 对 一些 流 行严 重 的家 特
１ ｍ ｎ后 弃 去 ， 标本 保持 一 定 的湿度 ， 后 滴加 适 ０ｉ 使 然 当稀释 的荧光 标记 的抗 体溶 液 ， 其完 全覆 盖标 本 ； 使
置 于有 盖搪瓷 盒 内 ， 温 ３ ｍ ｎ后 取 出玻 片 ， 保 ０ ｉ 置玻 片 架 上 ， 用 ０ １ ｏ／、Ｈ ． 先 ． ｔｌ ｐ ７ ０ｏ １ ４的 Ｐ Ｓ冲洗 后 ， 按 顺 Ｂ 再
１ 材 料 与 方 法
１１ 试 验 材料 ．
１１ １ 试 验 动 物 ．．
生理 盐 水 ，使 之 溶 解 ，再 加 （ Ｈ ） Ｏ 饱 和 溶 液 Ｎ ２ Ｓ １ ｍ ， 之 成 ３ ％（ Ｈ ） ０ 溶 液 ， 分 混 合 ， 置 ０ ｌ使 ３ Ｎ ２ Ｓ 充 静
３ ｍ ｎ后 ３Ｏ ０ ｍ ｎ离心 ２ ｍ ｎ 弃 上 清 ， 除去 白 ０ｉ ０ｄ ｉ ０ ｉ， 以 蛋白， 将此过 程重 复 ２ ３次。然后用 １ ｎ ～ ０ ｄ生理盐 水 溶解 沉淀 ， 入 透析 袋 ， 析除 盐 ， 常水 中透析 过 装 透 在 夜 （ 节 常水 的 ｐ ７ ） 再在 生理 盐水 中于 ４ 调 Ｈ． ， ０ ℃透析
１２． 。４ 兔 Ｉ Ｇ 的提 取 与 浓 缩 ｇ
小鼠卵清蛋白特异性IgEOVA-sIgE试剂盒使用方法
小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)试剂盒使用方法检测范围：96T0.8μg/ml -24μg/ml使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)水平。
用纯化的小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入OV A-sIgE，再与HRP标记的OVA-sIgE抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的OV A-sIgE呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OV A-sIgE)浓度。
试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（48μg/ml）0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
24μg/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液12μg/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液6μg/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液3μg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液1.5μg/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
豚鼠卵清蛋白特异性iggovasiggelisa试剂盒使用说明书.doc
豚鼠卵清蛋白特异性IgG(OVA sIgG)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置标准品稀释液：1.5ml×1瓶酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96）【豚鼠卵清蛋白特异性IgG(OVA sIgG)试剂盒】本试剂仅供研究使用计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒组成：封板膜:2片（48）/2片（96）说明书:1份密封袋:1个标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中豚鼠卵清蛋白特异性IgG(OVA sIgG)水平。
用纯化的豚鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A sIgG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵清蛋白特异性IgG(OV A sIgG)，再与HRP标记的卵清蛋白特异性IgG(OV A sIgG)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
小鼠卵清蛋白特异性IgGOVAsIgG试剂盒使用方法
小鼠卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)试剂盒使用方法检测范围：96T1μg/L -70μg/L使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)水平。
用纯化的小鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入OV A-sIgG，再与HRP标记的OV A-sIgG抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的OV A-sIgG呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)浓度。
试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（120μg/L）0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
60μg/L 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液30μg/L 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液15μg/L 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液7.5μg/L 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液3.75μg/L 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
二抗鼠抗兔IgG单克隆抗体
兔IgG IP二抗（Rabbit IgG IP-True Antibody）【品名】兔IgG IP 二抗：鼠抗兔IgG单克隆抗体Rabbit IgG IP-True Antibody: Mouse anti-Rabbit IgG Monoclonal Antibody【产品货号】 M0809-1【抗体类型】鼠单克隆抗体，一抗，IgG1, 克隆号：1-14【产品批号】M080825【种属特异】兔【抗体用途】IP, WB, ELISA【产品性状】液体【产品规格】100ul/管【抗体浓度】0.38mg/ml【产品简介】兔IgG IP二抗为鼠抗兔IgG单克隆抗体，该抗体不能识别经SDS-PAGE电泳分离的兔IgG 轻链与重链，可识别结构完整的兔IgG分子，即可识别自然状态下非变性的兔IgG分子。
在IP试验中，使用此抗体可以获得非常好的IP（immunoprecipitation）实验结果，避免兔IgG重链（50kDa）与轻链(25kDa)的干扰；另，对于蛋白质分子量与重链（50kDa）或轻链（25kDa）相接近的目标蛋白也能使用该抗体进行IP试验。
本产品未标记辣根过氧化物酶（HRP），在使用时需要与酶标抗兔IgG抗体（如HRP-羊抗兔IgG 抗体）配合使用。
【免疫原】纯化的兔IgG【推荐使用】IP 1:500-1,000; WB 1:500-1,000; ELISA 1:1,000-2,000【贮存】贮存于-20℃. 贮存缓冲液配方: 1*TBS (pH7.4), 0.5%BSA, 25%Glycerol. Preservative: 0.05% Sodium Azide.【有效期】12 个月【纯化方式】Balb/c小鼠腹水，Protein A纯化图1：目标蛋白分子量为37kDa..目标蛋白经抗目标蛋白兔多抗免疫沉淀试验，电泳转膜，使用RabbitIgG IP二抗检测，显示特异性目标蛋白条带，在兔IgG重链（50kDa）与轻链(25kDa)处没有出现相应的条带图2：兔IgG电泳后转膜，A:为Rabbit IgG IP二抗检测结果，不能识别兔IgG重链与轻链；B:使用常规抗兔二抗检测，显示兔I gG重链与轻链条带。
家兔免疫血清球蛋白分离与纯度鉴定
[3] 张丽娟, 张丽丽, 张丽华. 家兔免疫血清球蛋白分离与纯度鉴定[J]. 中国实验动物学报, 2021, 29(3): 740-745.
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浓度测定
采用BCA法测定免疫血清球蛋白浓度，结果显示浓度 符合预期。
结果分析
01
分离效果分析
离心和过滤技术能够有效地去除 杂质，获得较为纯净的免疫血清 球蛋白。
02
纯度鉴定分析
03
浓度测定分析
电泳和色谱分析结果表明，免疫 血清球蛋白纯度较高，达到实验 要求。
BCA法测定结果显示，免疫血清 球蛋白浓度符合预期，说明实验 过程中无严重损失。
纯度鉴定
纯度鉴定方法
SDS-PAGE电泳
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋 白质，通过染色和脱色后观察蛋 白条带，判断蛋白纯度。
免疫学检测
利用抗原-抗体反应检测特定蛋白 ，如ELISA、Western blot等， 可检测蛋白的特异性。
质谱分析
通过质谱技术对蛋白质进行定性 和定量分析，可精确测定蛋白序 列和相对分子量。
家兔免疫血清球蛋 白分离与纯度鉴定
目录
• 引言 • 家兔免疫血清球蛋白的分离 • 纯度鉴定 • 结果与讨论 • 结论 • 参考文献
01
CATALOGUE
引言
研究背景
免疫血清球蛋白在生物医学领域具有广泛应用，如诊断试剂、治疗药物等 。
家兔作为常用的实验动物，其免疫血清球蛋白具有相似但更为廉价的优点 。
结果与预期的对比及可能原因分析
分离效果与预期对比
免疫共沉淀用的对照igg抗体
免疫共沉淀用的对照igg抗体免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的实验技术，用于直接检测蛋白质间相互作用或特定蛋白质与其他分子的结合。
在进行免疫共沉淀实验时，通常需要使用对照IgG抗体。
对照IgG抗体是与目标抗体相对应的无特异性抗体，用于评估免疫共沉淀实验的特异性和背景噪音。
为什么需要对照IgG抗体？免疫共沉淀实验主要通过抗体与目标抗原的特异性结合来检测和分析特定蛋白质间的相互作用。
然而，有时目标抗体可能会非特异地结合到非目标蛋白质上或结合到实验中的其他成分上，导致误判结果。
为了排除这种背景干扰，需要引入对照IgG抗体。
对照IgG抗体的选择在选择对照IgG抗体时，应确保其来源与目标抗体一致，以避免由于物种差异而引起的非特异性背景信号。
对于小鼠单克隆抗体，通常使用小鼠IgG总蛋白或与目标抗体同源的小鼠IgG抗体作为对照。
对于兔子单克隆抗体，可以使用正常兔子IgG总蛋白作为对照。
对于鼠和兔混合体系的实验，可以选择与目标抗原无关的不同物种来源的IgG抗体作为对照。
对照IgG抗体的应用对照IgG抗体主要用于验证免疫共沉淀实验中的特异性沉淀结果。
一般来说，实验中的样品分为两组，一组使用目标抗体进行沉淀，另一组使用对照IgG抗体进行沉淀。
通过对比两组实验结果，可以判断目标抗体的特异性。
如果只有目标蛋白质在目标抗体组中被沉淀，而在对照IgG抗体组中未被沉淀，说明目标抗体的沉淀是特异的。
相反，如果在对照IgG抗体组中也观察到目标蛋白的沉淀，那么可以判定目标抗体的特异性较差，实验结果需要谨慎解读。
另外，对照IgG抗体还可以用于控制背景信号的定量。
对照IgG抗体通常与目标抗体一样进行免疫共沉淀实验，但在目标抗体与样品混合前，先与其相应的蛋白G/A磁珠结合。
通过比较对照IgG抗体的沉淀量和目标抗体的沉淀量，可以评估背景信号对实验结果的影响。
总结在免疫共沉淀实验中，对照IgG抗体起着重要的作用。
小鼠卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)试剂盒使用方法.doc
小鼠卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)试剂盒使用方法检测范围：96T1μg/L -70μg/L使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)水平。
用纯化的小鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入OV A-sIgG，再与HRP标记的OV A-sIgG抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的OV A-sIgG呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠卵清蛋白特异性IgG(OV A-sIgG)浓度。
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
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本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断兔（Rabbit）卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被抗卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
上海笃玛生物科技有限公司5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、60、120、240、480、960ng/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步骤1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样上海笃玛生物科技有限公司本浓度值。
试剂盒性能1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：最低检测浓度小于1.0ng/mL。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月免责声明1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。
上海笃玛生物科技有限公司FOR RESEARCH USE ONLY.NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.Rabbit ovalbumin specific IgG(OV A-sIgG)ELISA KitinstructionIntended useThis OVA-sIgG ELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from blue to yellow and the intensity of the color is measured at450nm using a spectrophotometer.In order to measure the concentration of OVA-sIgG in the sample,this OVA-sIgG ELISA Kit includes a set of calibration standards.The calibration standards are assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a standard curve of Optical Density versus OVA-sIgG concentration.The concentration of OVA-sIgG in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Sample collection and storagesSerum-Use a serum separator tube and allow samples to clot for30minutes before centrifugation for10minutes at approximately3000×g.Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at-20℃or-80℃.Avoid repeated freeze-thaw cyclesPlasma-Collect plasma using EDTA or heparin as an anticoagulant.Centrifuge samples for30minutes at3000×g at2-8℃within30minutes of collection.Store samples at-20℃or-80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Cell culture supernates and other biological fluids-Remove particulates by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at-20℃or -80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Note:The samples shoule be centrifugated dequately and no hemolysis or granule was allowed.Materials required but not supplied1.Standard microplate reader(450nm)2.Precision pipettes and Disposable pipette tips.3.37℃incubatorPrecautions1.Do not substitute reagents from one kit to another.Standard,conjugate and microplates are matched for optimal e only the reagents supplied by上海笃玛生物科技有限公司manufacturer.2.Do not remove microplate from the storage bag until needed.Unused strips should be stored at2-8°C in their pouch with the desiccant provided.3.Mix all reagents before using.Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature (20-25°C)Materials suppliedName96determinations48determinations Microelisa stripplate12*8strips12*4stripsStandard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubesSample Diluent 6.0ml 3.0mlHRP-Conjugate reagent10.0ml 5.0ml20X Wash solution25ml15mlChromogen Solution A 6.0ml 3.0mlChromogen Solution B 6.0ml 3.0mlStop Solution 6.0ml 3.0mlClosure plate membrane22User manual11Sealed bags11Note:Standard(S0→S5)concentration was followed by:0,60,120,240,480,960 ng/ml.Reagent preparation20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water1:20.Assay procedure1.Prepare all re a g e n t s before starting assay procedure.It is recommended that all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.2.Add standard:Set Standard wells,testing sample wells.Add standard50μl to standard well.3.Add Sample:Add testing sample10μl then add Sample Diluent40μl to testing sample well;Blank well doesn’t add anyting.4.Add100μl of HRP-conjugate reagent to each well,c over with an adhesive strip and incubate for60minutes at37°C.5.Aspirate each well and wash,repeating the process four times for a total of five washes.Wash by filling each well with Wash Solution(400μl)using a squirt bottle, manifold dispenser or plete removal of liquid at each step is essential to good performance.After the last wash,remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting.Invert the plate and blot it against clean paper towels.6.Add chromogen solution A50μl and chromogen solution B50μl to each well.上海笃玛生物科技有限公司上海笃玛生物科技有限公司Gently mix and incubate for 15minutes at 37°C.Protect from light.7.Add 50μl Stop Solution to each well.The color in the wells should changefrom blue to yellow.If the color in the wells is green or the color change does not appear uniform,gently tap the plate to ensure thorough mixing.8.Read the Optical Density (O.D.)at 450nm using a microtiter plate readerwithin 15minutes.Calculation of results1.This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample.The standard curve is generated by plotting the average O.D.(450nm)obtained for each of the six standard concentrations on the vertical (Y)axis versus the corresponding concentration on the horizontal (X)axis.2.First,calculate the mean O.D.value for each standard and sample.All O.D.values,are subtracted by the mean value of the zero standard before result interpretation.Construct the standard curve using graph paper or statistical software.3.To determine the amount in each sample,first locate the O.D.value on the Y-axis and extend a horizontal line to the standard curve.At the point of intersection,draw a vertical line to the X-axis and read the correspondingconcentration.4.Any variation in operator,pipetting and washing technique,incubation time or temperature,and kit age can cause variation in result.Each user should obtain their own standard curve.5.The sensitivity by this assay is 1.0ng/ml 6.StandardcurveStorage：2-8℃.validity：six months.FOR RESEARCH USE ONLY;NOT FOR THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC APPLICATIONS!PLEASE READ THROUGHENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!上海笃玛生物科技有限公司。