最新实验设计：卵清蛋白
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❖ 沉淀法是分离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可 分盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等。
❖ 蛋白质分子表面含有带电荷基团，这些基团与水分子有较大 的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白 质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐， 导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起 蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。
管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
试管号 试剂
1
2
3
4
5
6
7
8
9 提取液
标准蛋白溶液
/mL
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 1.0
蒸馏水/mL
蛋白质浓度 /mg/mL
4.0
3.5
3.0
2.5 2.0 1.5 1.0 0
3.0
0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0
实验设计：卵清蛋白
Contents
实验目的 实验原理 实验方法 实验材料及用品 实验步骤 实验注意事项
实验目的
1.掌握提取鸡蛋清中卵清蛋白的基本原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用方法及注意事项。 3.掌握用紫外吸收法测定蛋白质活性，了解其他测 定蛋白质活性的方法。
实验原理
❖ 一、沉淀法粗分离蛋白质
❖ 由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它 们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白 质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐 的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到 粗分离蛋白质的目的。
实验原理
❖ 鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在 半饱和硫酸铵溶液中析出，而卵清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才 能析出。
A280
实验步骤
（二）蛋白提取液中蛋白质含量测定 1、提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质 溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测 蛋白质的浓度。 排除干扰：将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的 吸收差求出蛋白质浓度。 2.计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260 （式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下 测得的光吸收值）
稀释液（以减少共沉淀） 逐滴加入 10mL 饱和硫酸铵溶液 边加边搅拌，饱和度为 50%
静置 10min 3000r/min 离心 15min
上清液 加入硫酸铵固体至不溶解为止
静置 10min 3000r/min 离心 15min
沉淀 10mL 生理盐水（20℃）
溶解 用 0.1mol/L 醋酸调 pH=4.6-4.8（卵清蛋白等电点）
盐析+等电点沉淀法
可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等。其 中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25℃可达4.1mol/L 的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分 段效果较其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的 生物学活性。等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来 分离具有不同等电点蛋白质的方法。
❖ 蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降 低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。
❖ 等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有 不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的 电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净 电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉 淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。
❖ 卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋白的等电点是5.1。
名称
卵清蛋白 伴清蛋白
蛋清中各种蛋白的理化性质
比例
分子量KDa
52%
45
13%
78
等电点 4.5 6.6
溶菌酶
11%
28
4.0-4.3
卵类粘蛋白 卵粘蛋白
免疫球蛋白
3.5% 1.5%
<1.0%
14 18(α ) 400(β) 不同
10.7 4.7
静置 10min 3000r/min 离心 15min
弃上清液
沉淀（卵清蛋白晶体） 5mL 生理盐水（20℃）
溶解（粗产品于 20℃以下保存）
实验步骤
二.卵清蛋白活性测定：
（一）紫外吸收法测定卵清蛋白的含量 1、标准曲线法 （1）标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各
不同
实验原理
二、蛋白质的活性测定
❖ 根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定 氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色 法等。
❖ 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双 键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 （A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
其他方法
凯氏定氮法，双缩尿法、Folin－酚、材料： 新鲜鸡蛋 ❖2、试剂： 饱和硫酸铵、硫酸铵结晶、生理盐水、
1mg/mL标准牛血清白蛋白液 ❖ 3、器具：紫外分光光度计、离心机、恒温水浴锅、
冰箱、电子天平
实验步骤
.
一
卵
清 蛋
弃沉淀
白
的 提 弃上清液
取
5mL 鸡蛋清（20℃） 5mL 生理盐水（20℃）
其他方法
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法：低温有机溶剂沉淀法 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法：透析与超滤 、凝胶过 滤法 （三）根据蛋白质带电性质进行分离：电泳法、离子交换层析法
实验方法
❖二.蛋白质活性测定 紫外吸收法
紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、 不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
❖ 由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干 扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定 260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影 响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm 的光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。
实验方法
❖一.蛋白质提取
❖ 蛋白质分子表面含有带电荷基团，这些基团与水分子有较大 的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白 质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐， 导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起 蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。
管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
试管号 试剂
1
2
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8
9 提取液
标准蛋白溶液
/mL
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 1.0
蒸馏水/mL
蛋白质浓度 /mg/mL
4.0
3.5
3.0
2.5 2.0 1.5 1.0 0
3.0
0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0
实验设计：卵清蛋白
Contents
实验目的 实验原理 实验方法 实验材料及用品 实验步骤 实验注意事项
实验目的
1.掌握提取鸡蛋清中卵清蛋白的基本原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用方法及注意事项。 3.掌握用紫外吸收法测定蛋白质活性，了解其他测 定蛋白质活性的方法。
实验原理
❖ 一、沉淀法粗分离蛋白质
❖ 由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它 们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白 质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐 的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到 粗分离蛋白质的目的。
实验原理
❖ 鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在 半饱和硫酸铵溶液中析出，而卵清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才 能析出。
A280
实验步骤
（二）蛋白提取液中蛋白质含量测定 1、提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质 溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测 蛋白质的浓度。 排除干扰：将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的 吸收差求出蛋白质浓度。 2.计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260 （式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下 测得的光吸收值）
稀释液（以减少共沉淀） 逐滴加入 10mL 饱和硫酸铵溶液 边加边搅拌，饱和度为 50%
静置 10min 3000r/min 离心 15min
上清液 加入硫酸铵固体至不溶解为止
静置 10min 3000r/min 离心 15min
沉淀 10mL 生理盐水（20℃）
溶解 用 0.1mol/L 醋酸调 pH=4.6-4.8（卵清蛋白等电点）
盐析+等电点沉淀法
可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等。其 中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25℃可达4.1mol/L 的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分 段效果较其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的 生物学活性。等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来 分离具有不同等电点蛋白质的方法。
❖ 蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降 低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。
❖ 等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有 不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的 电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净 电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉 淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。
❖ 卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋白的等电点是5.1。
名称
卵清蛋白 伴清蛋白
蛋清中各种蛋白的理化性质
比例
分子量KDa
52%
45
13%
78
等电点 4.5 6.6
溶菌酶
11%
28
4.0-4.3
卵类粘蛋白 卵粘蛋白
免疫球蛋白
3.5% 1.5%
<1.0%
14 18(α ) 400(β) 不同
10.7 4.7
静置 10min 3000r/min 离心 15min
弃上清液
沉淀（卵清蛋白晶体） 5mL 生理盐水（20℃）
溶解（粗产品于 20℃以下保存）
实验步骤
二.卵清蛋白活性测定：
（一）紫外吸收法测定卵清蛋白的含量 1、标准曲线法 （1）标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各
不同
实验原理
二、蛋白质的活性测定
❖ 根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定 氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色 法等。
❖ 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双 键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 （A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
其他方法
凯氏定氮法，双缩尿法、Folin－酚、材料： 新鲜鸡蛋 ❖2、试剂： 饱和硫酸铵、硫酸铵结晶、生理盐水、
1mg/mL标准牛血清白蛋白液 ❖ 3、器具：紫外分光光度计、离心机、恒温水浴锅、
冰箱、电子天平
实验步骤
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一
卵
清 蛋
弃沉淀
白
的 提 弃上清液
取
5mL 鸡蛋清（20℃） 5mL 生理盐水（20℃）
其他方法
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法：低温有机溶剂沉淀法 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法：透析与超滤 、凝胶过 滤法 （三）根据蛋白质带电性质进行分离：电泳法、离子交换层析法
实验方法
❖二.蛋白质活性测定 紫外吸收法
紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、 不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
❖ 由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干 扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定 260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影 响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm 的光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。
实验方法
❖一.蛋白质提取