罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立及应用

在增加了公共卫生安全的风险，这就需要研发采取一种快速、 １．１．１ 细菌菌株 罗非鱼 ＧＢＳ菌株、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
灵敏和可靠的污染链球菌检测方法，通过采取适当的防控措 ｃｏｌｉ）、沙 门 氏 菌 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、嗜 水 气 单 胞 菌 （Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
施，保护易感染群体免受这种人畜共患病原体的侵袭。
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｍａｓｓ
２０１７，１９：３１２－３２１．
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ＆ Ｗａｔｅｒ
［１７］ＬｉＬＸ，ＹａｎｇＸＭ，ＬｉＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
科学基金（编号：２０１５ＧＸＮＳＦＡＡ１３９０６８）。 作者简介：余艳玲（１９７６—），女，陕西咸阳人，硕士，工程师，主要从事
水产动物分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｅｌｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
（Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）与海豚 链 球 菌 （Ｓ．ｉｎｉａｅ），均 由 广 西 水 产 遗 传育种与健康养殖重点实验室鉴定和保存。 １．１．２ 主要试剂 细菌全基因组 ＤＮＡ提取试剂盒购自北京 康为世纪生物科技有限公司；ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ扩增试剂盒购自 日本荣研生物科技公司；ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、钙黄绿
包括野生鱼类［６－７］和养殖鱼类［８－９］严重的疾病，也可导致新生 评价。
儿严重的脑膜炎［１０］和成人败血症［１１－１２］。人类或牲畜的 ＧＢＳ 对罗非鱼具有潜在的感染性［１３］，而来自罗非鱼的 ＧＢＳ也可能 导致人类感染［１４］。因此，罗非鱼和 ／或水环境中 ＧＢＳ菌株的存
１ 材料与方法 １．１ 试验材料
余艳玲１，彭 昊２，冯世文２，张永德１，罗洪林１，李 军２
（１．广西水产科学研究院 ／广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 ５３００２１； ２．广西兽医研究所 ／广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 ５３０００１）
摘要：针对罗非鱼无乳链球菌 Ｓｉｐ基因建立了 ＬＡＭＰ检测方法，并对野外样本进行了无乳链球菌的调查研究。结ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 表明，目标 Ｓｉｐ基因可在 ６３℃ ４０ｍｉｎ内被 ＬＡＭＰ检测到，比 ＰＣＲ快约 ２ｈ，其 ＤＮＡ检测最低浓度为 ３．５５×１０－５ ｎｇ／μＬ， 灵敏度比 ＰＣＲ高 １００倍，且对参考细菌无扩增。野外样品检测结果表明，运用 ＬＡＭＰ检测技术对 ＧＢＳ的检出率为 ８１３％，比 ＰＣＲ高约 ２０．０％。应用 ＬＡＭＰ和 ＰＣＲ分别检测健康罗非鱼 ＧＢＳ检出率 ４．４％和 ２．２％，检测池塘水样品 ＧＢＳ检出率分别为 １０．０％和 ６．７％。 关键词：罗非鱼；无乳链球菌（ＧＢＳ）；环介导等温扩增（ＬＡＭＰ） 中图分类号：Ｓ９１７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１９）１３－０２００－０４
— ２００—
江苏农业科学 ２０１９年第 ４７卷第 １３期
余艳玲，彭 昊，冯世文，等．罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）检测技术的建立及应用［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（１３）：２００－２０３． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．１３．０４９
罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增（ＬＡＭＰ） 检测技术的建立及应用
本的检测方法，在等温条件下扩增靶基因核苷酸，通常在 １ｈ 内完成 ［１５－１６］，扩增产物 可 通 过 浊 度 或 荧 光 染 料 监 测。 此 外， ＬＡＭＰ检测可 在 野 外 进 行，因 此 可 用 于 现 场 测 定［１６］。基 于
族链球菌或 ＧＢＳ）。过去 ５年，由链球菌导致的罗非鱼死亡率 ＬＡＭＰ的优点，本研究开发了一种针对 ＧＢＳＳｉｐ基因可用于野 达 １５％ ～９５％ 。 ［２］ ＧＢＳ不仅会引起水生或半水生生物 ， ［４－５］ 外现场检测 的 单 步 ＬＡＭＰ法，并 对 其 特 异 性 和 灵 敏 性 进 行
链球菌病已成为全球罗非鱼最严重的疾病之一［１］，每年
环介导等温扩 增 技 术 （ＬＡＭＰ）是 一 种 敏 感、快 速 和 低 成
造成的经济损失达 ４０００多万美元［２－３］。过去数十年，我国 罗非鱼 链 球 病 逐 年 增 长，其 优 势 种 类 已 经 从 海 豚 链 球 菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）转变为无乳链球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ，也称 Ｂ
ｆｏｒｒｅｍｏｖａｌｏｆｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ，ｍａｃｒｏ－ ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓａｎｄ ｄｙｅ ｆｒｏｍ ［２０］ＺｈｏｕＱ，ＺｈａｎｇＧ Ｍ，ＬｕＹ Ｆ，ｅｔａｌ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｓｔｕｄｙａｎｄｐｒｏｃｅｓｓ
ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ：ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＷａｔｅｒＰｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、维氏 气 单胞 菌 （Ａｅｒｏｍｏｎａｓｖｅｒｏｎｉｉ）、爱德 华 氏 菌
（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｉｃｔａｌｕｒｉ）、哈 氏 弧 菌 （Ｂｒｉｏｈａｔｖｅｙｉ）、创 伤 弧 菌
收稿日期：２０１８－０４－０８ 基金项目：国家自然科学 基 金 面 上 项 目 （编 号：３１３７２５５３）；广 西 自 然
重庆：西南大学，２０１５．
［１９］宋协法，潘玉兰，马 真，等．单 菌 种 和 混 合 菌 处 理 养 殖 污 水 的
［１６］ＴａｌａｉｅｋｈｏｚａｎｉＡ，ＲｅｚａｎｉａＳ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ
效果［Ｊ］．环境工程学报，２０１５，９（７）：３２８１－３２８７．
通信作者：李 军，副研究员，主要从事动物疫病防控与病原分子生 素等，购自天根生化科技（北京）有限公司。
物学研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｌｅｅ９９８１＠１６３．ｃｏｍ。
１．１．３ 待检样品 ２０１４年 ７—９月，从野外共收集样品 ４９０
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄