第15章紫杉醇生产工艺0623

第十五章紫杉醇生产工艺

学习目标

了解紫杉醇类药物的临床应用和工艺路线研究现状，理解紫杉醇侧链原料合成工艺原理。掌握紫杉醇半合成生产工艺原理，熟悉合成工艺的控制。

紫杉醇于1992年被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌，1994年被批准用于治疗转移性乳腺癌，1997年FDA批准使用紫杉醇治疗爱滋病关联的Kaposi恶性肿瘤。1998年和1999年，FDA又分别批准半合成紫杉醇与顺铂联合使用作为治疗晚期卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。2004年FDA批准白蛋白修饰的紫杉醇，降低毒性，提高疗效。紫杉醇是近几年国际公认的疗效确切的重要抗肿瘤药物之一。本章介绍紫杉醇的手性半合成生产工艺。

15.1 概述

1958－1987年，美国国立癌症研究所（NCI）用多种鼠肿瘤移植模型，对全世界3.5万种植物的11万个植物提取物进行筛选。于1964年实验证明了太平洋红豆杉皮中的提取物具有活性，1969年确定了紫杉醇为其中活性成分。1971年美国化学家Wani 和Wall从太平洋红豆杉的树皮中提纯得到紫杉醇。紫杉醇被誉为是随机筛选药物的成功范例。本节分析紫杉醇和多烯紫杉醇的结构和合成工艺路线的研究进展。

15.1.1 紫杉醇类药物

（1）紫杉醇（paclitaxel，Taxol®），化学名称为5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,13α-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-[(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯]，英文化学名称为13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-benmethyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4- acetate-2-benzoate。

紫杉醇具有复杂的化学结构，属三环二萜类化合物，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成（图15-1）。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式为C47H51NO14，分子量为853.92。紫杉醇难溶于水，易溶于甲醇、二氯甲烷和乙腈等有机溶剂。

图15-1紫杉醇和多烯紫杉醇的化学结构

紫杉醇具有独特的抗癌机制，其作用靶点是有丝分裂和细胞周期中至关重要的微管蛋白。紫杉醇与β微管蛋白N端第31位氨基酸和217－231位结合，能促进微管蛋白聚合而形成稳定的微管，并抑制微管的解聚，将细胞周期阻断于G2/M期，从而抑制了细胞的有丝分裂，最终导致癌细胞的死亡。近几年的研究表明，紫杉醇还具有其他生物学效应，与信号转导蛋白质的磷酸化有关，持续激活MAPK等，诱导多种肿瘤细胞的凋亡。

（2）多烯紫杉醇（多西他赛，docetaxel，Taxotere®），紫杉醇类似物，差异在于母环10位和侧链3'位的取代基不同。多烯紫杉醇的化学名称是5β, 20-环氧-1β, 2α, 4α, 7β, 10β, 13α-六羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2′R,3′S)-N-叔丁氧羰基-3′-苯基异丝氨酸酯]三水合物，英文化学名称为-13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-tertbutyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β, 2α, 4α, 7β, 10β, 13α-hexahydroxytax-11- en-9-one-4-acetate-2-benzoate, trihydrate。分子式为C43H53NO14•3H2O，相对分子质量为861.9。

1985年，法国罗纳普朗克乐安（Rhone-Poulenc Rorer）公司和法国国家自然科学研究中心以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目前多烯紫杉醇主要由A VENTIS公司（法国罗纳普朗克乐安公司与德国赫斯特合并后的新公司）生产，已在多个国家上市使用。

多烯紫杉醇是紫杉醇家族第二代抗癌新药的代表，它与紫杉醇有相同的作用机制，但抑制微管解聚、促进微管二聚体聚合成微管的能力是紫杉醇的两倍。多烯紫杉醇还能够抑制细胞DNA、RNA或蛋白质的合成。多烯紫杉醇的IC50值（肿瘤细胞存活减少50%）范围为4-35 ng/mL，对某些类型肿瘤细胞的抑制活性比紫杉醇高10倍。此外，多烯紫杉醇还具有较好的生物利用度，更高的细胞内浓度，更长的细胞内潴留时间等。

15.1.2 紫杉醇的工艺路线研究

（1）天然提取工艺路线紫杉醇的来源最初以天然提取为主，主要是从由红豆杉属（Taxus）植物的树皮中分离得到。目前红豆杉濒临灭绝，属于保护物种，天然提取路线已被迫放弃。

（2）化学全合成工艺路线紫杉醇的分子结构十分复杂，有众多的功能基团和立体化学特征，是对化学全合成的一个挑战。到目前为止，文献报道的紫杉醇的全合成路线共有3条，即1994年由Holton和Nicolaou研究组几乎同时完成的2条路线以及1996年Danishefsky

小组报道的路线。

①Holton路线策略是A→AB→ABC，又称为线性合成路线。以倍半萜化合物（pachioulene oxide, 商品名Pachino）为起始化合物，它具有与天然紫杉醇一致的C1-和C19-CH3构象。通过片段反应生成B环，进而合成六元环。

②Nicolaou路线先通过Diels-Alder反应合成A环和C环，再通过McMurry反应合成八元B环，得到ABC三环化合物，所以被称为会聚式路线。

③Danishefsky路线与Nicolaou路线的策略基本相同。较早阶段引入四元氧环（D环），再将含有A和C、D环的片段连接，最后合成八元B环。

紫杉醇的全合成中，反应步骤多达20—25步，大量使用手性试剂，反应条件极难控制，制备成本昂贵，缺乏经济性和环保性，虽然具有重要的理论意义，但未被用于工业生产。

（3）生物合成工艺路线紫杉醇是红豆杉的次生代谢产物，主要存在于红豆杉属植物的树皮及针叶中。为解决紫杉醇的大量供应问题，人们研究了三种生物合成紫杉醇的技术路线。

①红豆杉细胞培养工艺用红豆杉的细胞或韧皮部的细胞，进行细胞培养，然后分离纯化制备紫杉醇。已有前体饲喂、添加诱导子、两相培养等技术在红豆杉细胞培养中使用。该技术曾获得美国总统绿色化学挑战奖。

②真菌发酵工艺路线1993年Stierle等人在《科学》杂志报道了从紫杉树中分离出来的内生真菌（Taxomyces andreanae）可以合成紫杉醇和紫杉烷，但至今未见到突破性的研究报道和应用。

③工程大肠杆菌发酵工艺路线从20世纪80年代开始，华盛顿州立大学的Croteau教授实验室从红豆杉植物中克隆了紫杉醇生物合成的大部分基因，因而逐步阐明紫杉醇生物合成的基本途径，包括三个阶段，四环母核的生成，侧链的生成，母核与侧链的酯化反应，最后形成完整的紫杉醇分子。

紫杉醇的四环母核的碳骨架是通过二萜途径合成的。由GGPPS催化1分子DMAPP和3分子IPP聚合，生成GGPP。紫杉二烯合成酶催化GGPP生成具有A、B、C三环的紫杉二烯，此时紫杉醇母核的碳骨架结构基本形成。随后，在C4和C5位形成环氧丙烷D环，通过氧化和酰基化修饰，形成巴卡亭III。

苯丙氨酸是紫杉醇C13酯侧链的前体，由苯丙氨酸氨基变位酶催化，2S-α-苯丙氨酸转变成3R-β-苯丙氨酸。由C13-苯基丙酸-侧链-CoA 转移酶催化，β-苯丙氨酸与巴卡亭Ⅲ的C13氧原子结合。β-苯丙氨酸C2＇位发生羟基化，但该基因还未鉴定出来；由紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转移酶催化，β-苯丙氨酸侧链C3＇位N原子发生苯甲酰化，而生成紫杉醇。

目前，已经推测得到紫杉醇生物合成大约有19步，其中已有13步基因的编码酶在大肠杆菌和酵母中表达，成功得到确证。紫杉醇特有的环氧丙烷环，C9羰基及C1位和C2′位的羟化酶还有待进一步研究。

美国麻省理工学院科学家通过代谢工程和合成生物学的研究，构建了工程大肠杆菌，通过工艺优化，能合成紫杉二烯及其羟化产物，产量达到克级以上。随着紫杉醇生物合成途径