实验七_植物DNA的提取与纯度鉴定

实验试剂及其配置
• 6 高盐 溶液（pH 8.0） （要求配 高盐TE溶液（ 溶液 ） 要求配50mL） ）
试剂 1 M pH 8.0 Tris·Cl 0.5 M pH 8.0 EDTA NaCl
需要量/L 需要量 10 mL 0.2 mL 58.5g
终浓度 10 mmol/L 0.1 mmol/L 1 mol/L
需要量/L 需要量 20 g 100 mL 40 mL 82 g
终浓度 2％（ ） ％（w/v） ％（ 100 mmol/L 20 mmol/L 1.4 mol/L
实验试剂及其配置
2 1 M pH 8.0 Tris·Cl（已有不用配置） （已有不用配置）
121 g Tris碱溶于 碱溶于800 mL dd H2O，浓HCl调pH至8.0，补dd H2O定容 碱溶于 ， 调 至 ， 定容 至1000 mL。 。 注意： 缓冲液的pH值随温度变化较大 注意：Tris缓冲液的 值随温度变化较大，每1℃可引起大约 缓冲液的 值随温度变化较大， ℃可引起大约0.028 pH单位的变化。 单位的变化。 单位的变化
实验七 植物DNA的提取与纯度鉴定 的提取与纯度鉴定 植物
谢 艳
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实验目的 实验原理 实验材料 实验试剂 实验仪器 实验步骤 注意事项
实验目的
• 了解植物总 了解植物总DNA提取的原理 提取的原理 • 学习和掌握提取、纯化高等植物总DNA的 学习和掌握提取、纯化高等植物总 掌握提取 的 方法和步骤
背景知识 1
不同生物须选择不同DNA提取方法 提取方法 不同生物须选择不同
不同生物（ 植物、 动物、 微生物） 不同生物 （ 植物 、 动物 、 微生物 ） 的基因组 DNA的提取难易度不同： 的提取难易度不同： 的提取难易度不同 对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较 对于低等生物，如从病毒中提取 比较 容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保 分子量较小， 容易，多数病毒 分子量较小 持其结构完整性。 持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一 难度大一 从细菌及高等动植物中提取 细菌DNA 分子量较大，一般达 ×10 道尔 分子量较大，一般达2× 些。细菌 因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核 顿。因此易被机械张力剪断。细菌 ， DNA 外，还有质粒 还有质粒DNA 等。
实验材料
• 烟草嫩叶
实验仪器和设备
研钵、研棒、水浴锅、 研钵、研棒、水浴锅、高速冷冻离心机 移液器及配套吸头、 移液器及配套吸头、50ml＆10ml量筒 ＆ 量筒 1.5ml离心管 、 50mL离心管 离心管 离心管
实验试剂及其配置
1.
CTAB抽提液 （要求配 抽提液 要求配100mL） ）
试剂 CTAB 1 M pH 8.0 Tris·Cl 0.5 M pH 8.0 EDTA NaCl
背景知识 4
真核细胞基因组提取的方法
DNA提取基本方法： 提取基本方法： 提取基本方法 1. 机械法破碎细胞 2. 去除蛋白质，酚类等细胞内杂质污染 去除蛋白质， 3. 纯化ＤＮＡ 纯化ＤＮＡ
• • • • •
浓盐法 离子去污剂法 苯酚抽提法 水抽提法 CTAB法 法
CATB法的简析 法的简析
• • • • • • • 冷冻和研磨， 冷冻和研磨，使细胞破裂 加入CTAB提取缓冲液，溶解 提取缓冲液， 加入 提取缓冲液 溶解DNA 氯仿/异戊醇抽提 异戊醇抽提， 氯仿 异戊醇抽提，去除蛋白 加入无水乙醇/异丙醇 沉淀DNA 异丙醇， 加入无水乙醇 异丙醇，沉淀 酒精冲洗， 酒精冲洗，去除剩余杂质 RNase消化，去除 消化， 消化 去除RNA 无菌水/TE溶解，保存 溶解， 无菌水 溶解 保存DNA
实验试剂及其配置
3 0.5 M pH 8.0 EDTA (乙二胺四乙酸 )
（要求配100mL） 要求配 ）
29.22 g EDTA溶于 溶于140 mL水中，用固体 水中， 溶于 水中 用固体NaOH 定容至200 mL。 调pH至8.0，补ddH2O定容至 至 ， 定容至 。
作用： 螯合二价离子， 酶的活性， 作用：EDTA螯合二价离子，抑制 螯合二价离子 抑制DNA 酶的活性，保护 DNA
如动植物中， 小牛胸腺、 动物肝脏、 鱼类精子； 如动植物中 ， 小牛胸腺 、 动物肝脏 、 鱼类精子 ； 植物 种子的胚中都含有丰富的DNA。 种子的胚中都含有丰富的 。 如微生物中， 谷氨酸菌体含7%-10%， 面包酵母含 如微生物中 ， 谷氨酸菌体含 ， 面包酵母含4%， ， 啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%-10%。 啤酒酵母含 ，大肠肝菌含 。
核酸的理化性质
DNA和RNA都是极性化合物，一般都溶于水或 和 都是极性化合物， 都是极性化合物 一般都溶于水或1mol/L的NaCl 的 溶液中，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 溶液中，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。核酸的钠盐比游离酸易 溶于水， 钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为 在水中为10g/L， 溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达 钠盐在水中溶解度可达 。 在水中为 ， 呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中， 易水解， 呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或 、 易水解 弱碱性溶液中较稳定。 弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。 DNP在 形式存在。 天然状态的 形式存在 在 盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。 盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液 在低浓度盐溶液 几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠中溶解度最低，仅为 的氯化钠中溶解度最低， 中，几乎不溶解，如在 的氯化钠中溶解度最低 在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加， 在水中溶解度的 ，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至 1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高 倍。 氯化钠中的溶解度很大， 氯化钠中的溶解度很大 比纯水高2倍
要求配50mL） • 8 75% 乙醇 （要求配 ）
实验步骤（1）
• 1、 CTAB抽提液 ℃预热；异丙醇－20℃预冷； 、 抽提液65℃预热；异丙醇－ ℃预冷； 抽提液 • 2、 称取新鲜烟草叶片 克，加液氮研磨，共加 次液氮； 、 称取新鲜烟草叶片1克 加液氮研磨，共加3-4次液氮 次液氮； • 注意： 注意： • (1) 研磨时应注意防止液氮冻伤，戴上一次性 手套； 研磨时应注意防止液氮冻伤，戴上一次性PE手套 手套； • (2) 新鲜的本氏烟较易磨碎，加液氮3-4次；杂草样品特别是 新鲜的本氏烟较易磨碎，加液氮 次 不新鲜的杂草样品常较难磨，加液氮4-5次 一般加液氮4次 不新鲜的杂草样品常较难磨，加液氮 次。一般加液氮 次； • (3) 加液氮时动作轻柔，否则液氮会将样品冲出而造成样品 加液氮时动作轻柔， 损失； 损失； • (4) 磨样过程中，样品不能溶化，样品研磨得越细越好； 磨样过程中，样品不能溶化，样品研磨得越细越好； • (5) 每换一个新样品，要换一次 手套。 每换一个新样品，要换一次PE手套 手套。
实验试剂及其配置
• 5 3 M NaAC pH 5.2 （要求配 要求配50mL） ）
• 81.62 g NaAC·3H2O / 49.22 g 无水 无水NaAC溶于 溶于 160 mLddH2O中，冰乙酸调 至5.2，定容至 中 冰乙酸调pH至 ， 200 mL，高压灭菌。 ，高压灭菌。
• 作用：Na离子中和 作用： 离子中和 离子中和DNA分子上的负电荷，减少 分子上的负电荷， 分子上的负电荷 减少DNA分子 分子 同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀， 钠盐沉淀， 同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 钠盐沉淀 使沉淀更完全。 使沉淀更完全。
CTAB法实验原理 法实验原理
• 离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵 (hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为 ， CTAB)、十二烷基硫酸钠 、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate， ， 简称SDS)等可以有效裂解植物细胞壁，且与 等可以有效裂解植物细胞壁，且与DNA 简称 形成可溶于高盐溶液的复合物， 形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时 DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。 又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。 又可沉淀析出
实验试剂及其配置
4 CTAB/NaCl (10% CTAB, 0.7 M NaCl) 要求配50mL） （要求配 • • • • CTAB NaCl 20 g 8.2 g
加入160 mL ddH2O，加热至 ℃溶解，补dd 加入 ，加热至65℃溶解， H2O定容至 定容至200 mL，高压灭菌。 定容至 ，高压灭菌。 注意：此溶液很粘稠，使用时需加热至 ℃ 注意：此溶液很粘稠，使用时需加热至65℃。
作用： 作用：DNA保存更稳定 保存更稳定
实验试剂及其配置
• 7 24：1的氯仿（三氯甲烷）/异戊醇 （要 的氯仿（ ： 的氯仿 三氯甲烷） 异戊醇性蛋白质，异戊醇消除气泡 注意：混匀过程要轻柔，以免DNA断裂 断裂。 注意：混匀过程要轻柔，以免DNA断裂。
实验步骤（2）
• 3、 最后一次加液氮磨样后，立即加入预热的 、 最后一次加液氮磨样后，立即加入预热的CTAB抽提 抽提 抽提液， 液，每克叶片加入8 mL CTAB抽提液，再加入 每克叶片加入 抽提液 再加入160 µL 2－ － 巯基乙醇（2-Me）（终浓度2％（ ））。继续研磨待 巯基乙醇（ ）（终浓度 ％（v/v））。继续研磨待 ）（终浓度 ％（ ））。 CTAB抽提液溶化后，将研磨液转入50 mL离心管； 抽提液溶化后，将研磨液转入 离心管； 抽提液溶化后 离心管 • 4、 65℃水浴锅温浴 、 ℃水浴锅温浴0.5-1小时，每10-20分钟摇动一次离心 小时， 小时 分钟摇动一次离心 管；同时65℃预热 同时 ℃预热CTAB/NaCl； ； 注意：离心管盖子应轻轻搭在管口，千万不能盖紧， 注意：离心管盖子应轻轻搭在管口，千万不能盖紧， 以防加热使盖子冲出，最好离心管壁和盖子同时做好标记。 以防加热使盖子冲出，最好离心管壁和盖子同时做好标记。
背景知识 2
同一生物不同部位DNA含量不同 含量不同 同一生物不同部位
为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要 分子在生命代谢中的作用， 为了研究 分子在生命代谢中的作用 从同一生物的不同的部位提取DNA。但由于 从同一生物的不同的部位提取 。但由于DNA分 分 子在生物体内的分布及含量不同， 子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材 料提取DNA。 料提取 。
具体
• CTAB、SDS等离子型表面活性剂能溶解细 、 等离子型表面活性剂能溶解细 胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚， 胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA得以游离出来。再加入苯酚 / 氯仿等 得以游离出来。 得以游离出来 有机溶剂，使蛋白质变性， 有机溶剂，使蛋白质变性，并使抽提液分 因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经 水溶性很强， 相，因核酸 、 水溶性很强 离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大 部分蛋白质。 部分蛋白质。上清液中加入异丙醇 / 无水乙 醇使DNA沉淀，沉淀 沉淀， 溶于TE或水溶液 醇使 沉淀 沉淀DNA溶于 或水溶液 溶于 即得植物总DNA溶液。 溶液。 中，即得植物总 溶液
背景知识 3
提醒 不同种类或同一种类的不同组织因其细 胞结构及所含的成分不同， 胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差 在提取某种特殊组织的DNA时必须参照 异。在提取某种特殊组织的 时必须参照 文献和经验建立相应的提取方法， 文献和经验建立相应的提取方法，以获得可 用的DNA大分子 大分子， 用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酚 类物质对随后的酶切、 类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的 反应等有较强的 抑制作用， 抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取 基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。 基因组 时 应考虑除去多糖和酚类物质。