白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsRNA

摘要：［目的］构建白蜡虫（Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ）蜡酯合酶（ｗａｘｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷＳ）基因干扰载体并建立其体外 ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ
ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）原核表达体系，低成本大量制备白蜡虫 ｗｓ基因的 ｄｓＲＮＡ。［方法］克隆白蜡虫蜡酯合酶基因
ｗｓ片段，连入 Ｌ４４４０载体，将重组质粒转入大肠杆菌 ＨＴ１１５感受态细胞，经 ＩＰＴＧ诱导获得与目的片段相对应的
生物蜡酯普遍存在于自然界生物中，蜡酯对生 物生命活动具有储能、保护等诸多功能，在生物生命 活动中扮演的角色极为重要［１－３］。昆虫和植物体表 的蜡酯层能对抗有害细菌及真菌入侵，同时还能减 少体表水分蒸发、疏水御潮、防止紫外辐射、反射阳
光辐射、躲 避 天 敌 袭 击［４－７］。 有 些 昆 虫 则 特 化 了 泌 蜡的性状，比如介壳虫，这一类昆虫体表覆盖大量蜡 泌物形成的介壳［８］，由于蜡酯的保护，常规方法很难 达到防治效果，喷洒、涂抹等机械方法和化学治理方 法也较为困难不容易操作，且污染环境、耗资大、大
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｈｉｓｓｔｕｄｙａｉｍｓａｔｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒｏｆＥｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａｗａｘｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｖｉｔｒｏ，ａｎｄｐｒｅｐａｒｅａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ｏｆＥ．ｐｅｌａｗｓ ｇｅｎｅａｔｌｏｗｃｏｓｔ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅｃｌｏｎｅｄＥ．ｐｅｌａｗｓｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏＬ４４４０ｖｅｃｔｏｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＥ． ｐｅｌａｗｓＬ４４４０ｇｅｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＨＴ１１５ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ，ｔｈｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｔｏｇｅｔｔｈｅｄｓＲＮＡｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔ．［Ｒｅｓｕｌｔ］ＴｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒｏｆＥｒｉｃｅｒｕｓ ｐｅｌａｗｓｇｅｎｅｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏ，ａｎｄｔｈｅｄｓＲＮＡｃａｎａｌｓｏｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＨＴ１１５ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ ｗｉｔｈｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ．ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｓＲＮＡｗａｓ１７０５ｎｇ·ｍＬ－１． ［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｄｓＲＮＡｏｆＥ．ｐｅｌａｗｓｇｅｎｅｂｙｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｍａｙｌａｙｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒｕｓｉｎｇＲＮＡｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆＥ．ｐｅｌａｗｓｇｅｎｅ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ；ＷＳ；Ｌ４４４０；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｄｓＲＮＡ
第 ４期
王雪庆，等：白蜡虫 ｗｓ基因 ＲＮＡｉ载体构建及原核表达 ｄｓＲＮＡ
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量杀伤天敌，介壳虫已成为农林果树危害严重的害 虫。如果对蜡酯进行破坏，则易达到介壳虫防治的 效果。
不同物 种 的 蜡 酯 合 酶 （ｗａｘｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷＳ）研 究 显示，在 生 物 蜡 酯 合 成 过 程 中 ＷＳ具 有 关 键 作 用［９－１２］。笔者以我国历史悠久的特产 资 源 昆 虫— 白蜡虫（一种 介 壳 虫）为 研 究 对 象，鉴 定 出 白 蜡 虫 ＷＳ，实验表明 ＷＳ在白蜡虫泌蜡中发挥极其重要的 作用［１３］。近年来，昆虫中对未知基因功能及作用机 理研究主要是利用 ｄｓＲＮＡ诱导的 ＲＮＡｉ实现［１４］，由 此本研究欲探索较低成本获取 ｄｓＲＮＡ，以期建立一 种通过原核菌体表达获取大量白蜡虫 ｗｓ基因 ｄｓＲ ＮＡ的方法，从而为介壳虫防治提供一定参考。
关键词：白蜡虫；ＷＳ；Ｌ４４４０；原核表达；ｄｓＲＮＡ
中图分类号：Ｓ８９９．１
文献标识码：Ａ 文章编号：１００１１４９８（２０１８）０４００７００５
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡ ＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＶｅｃｔｏｒｏｆＥｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ（Ｃｈａｖａｎｎｅｓ） ｗｓＧｅｎｅａｎｄＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｄｓＲＮＡ ｂｙＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
林 业 科 学 研 究 ２０１８，３１（４）：７０ ７４ ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ ＤＯＩ：１０．１３２７５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｌｙｋｘｙｊ．２０１８．０４．０１０
白蜡虫 ｗｓ基因 ＲＮＡｉ载体构建及原核表达 ｄｓＲＮＡ
百度文库王雪庆，赵遵岭，孙 涛，陈晓鸣，杨 璞
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 ６５０２２４）
ＷＡＮＧＸｕｅｑｉｎｇ，ＺＨＡＯＺｕｎｌｉｎｇ，ＳＵＮＴａｏ，ＣＨＥＮＸｉａｏｍｉｎｇ，ＹＡＮＧＰｕ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓｏｆ ＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
收稿日期：２０１７１０２５ 基金项目：林业公益性行业科研专项 ２０１５０４３０２；国家自然科学基金 ３１５７２３３７；中央级科研院所基金 ＣＡＦＹＢＢ２０１７ＺＢ００５ 作者简介：王雪庆（１９９３—），女，硕士研究生．研究方向：昆虫分子生物学．Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｕｅｑｉｎｇ１０１８＠１６３．ｃｏｍ 通讯作者：杨 璞，研究员，主要从事分子生物学研究．Ｅｍａｉｌ：ｚｊｕｙａｎｇｐｕ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
ｄｓＲＮＡ。［结果］白蜡虫 ｗｓ基因 ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）载体成功构建，重组质粒转入 ＨＴ１１５感受态细
胞经 ＩＰＴＧ诱导后菌体成功表达 ｄｓＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ的平均获得量 １７０５ｎｇ·ｍＬ－１。［结论］该研究通过原核表达白蜡
虫 ｗｓ基因的 ｄｓＲＮＡ，为后续利用 ＲＮＡｉ实验研究白蜡虫 ｗｓ基因功能及作用机理奠定基础。