抗原和抗体的制备

4、表面活性剂处理法
原理： 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，
表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透 性改变或使之溶解。 常用的有：
十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺 十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子 型）、新洁尔灭等。 应用：
破碎细菌，且作用比较温和。
抗原的纯化
1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法
盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）， 常用33～50％饱和度的硫酸胺。 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。
3、凝胶层析法
• 原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适 当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不 一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先 后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行 分离。
免疫学技术有在食品安全 检测中的应用
抗原的准备 抗体的制备 常用的免疫学检测技术
第一节抗原的准备
天然抗原的制备 人工抗原的制备 合成抗原
抗原制备的主要技术途径
天然抗原——分离、纯化 半抗原——人工合成、载体联接 抗原肽—— 合成、基因工程制备
天然抗原的制备
颗粒抗原的制备 可溶性抗原
蛋白抗原 多糖抗原
半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2
颗粒抗原的制备
1、血红细胞抗原的制备： 动物的新鲜血液+抗凝剂
离心去上清 NS悬浮
离心洗涤三次（2000转/分）
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动15-20min
周可
ห้องสมุดไป่ตู้4℃
保
存
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
颗粒抗原的制备
2、细菌抗原的制备 细菌培养（37 ℃ ，24小时） 杀菌（100 ℃ ，2小时） NS稀释 菌体抗原
• 常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex 柱）
凝胶层析（分子筛）
4、离子交换层析法
• 原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带 相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同， 所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度 洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子 与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的 蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等 几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。
1、超速离心法
原理: 利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使
具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯 度层内，达到彼此分离的目的。 应用：
用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗 原物质的分离，如IgM、载脂蛋白A、B等。
2、选择性沉淀法
原理： 根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉
淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀， 从而达到纯化的目的。 常用方法：
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无活菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌细胞抗原的制备流程图
O菌体抗原
可溶性抗原的分离纯化
种类：蛋白质多糖和细菌毒素。 细胞内存在的部位：胞外抗原和胞内抗原。 胞外抗原:收集培养液或分泌物。 胞内抗原:提取、分离和纯化。
胞内抗原的提取、分离和纯化
细胞的破碎 分离纯化
细胞的破碎
1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理
1、酶处理法
常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 特点：
①适用于多种微生物； ②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
2、冻融法
• 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂 浓度的突然改变而破坏细胞。
半抗原免疫原的制备
1.半抗原： 低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、
脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其 他化学物品等。 2.载体：蛋白质类
多肽聚合物 大分子聚合物 3.半抗原-载体连接方法
载体类型
1.蛋白质： 人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛
甲状腺球蛋白等。 2.多肽聚合物：
混合
搅拌1～2h
R-NH=CH-R’ 室温
人工免疫原
透析除去未反 24h
应的半抗原
戊二醛法:
半抗原-NH2 载体蛋白-NH2
OHC-(CH2)3-CHO
混合
半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白
*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂
半抗原-载体连接方法3
氯甲酸异丁脂法： 半抗原-COOH Cl-COO-CH2CH(CH3)2
人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大 （可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后， 可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。 3.大聚合物：
羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结 合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。
半抗原-载体连接方法1
碳化二亚胺法：
半抗原＋载体蛋白质
— —
+ + ++
— —+
+ —
—
+
+
+ +
+
— —
—
— —
+ +
+ + +
离子交换层析
5、亲和层析法
• 原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的 技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制 成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的 IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG) 结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗 脱下来，达到纯化的目的。
• 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化， 如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被 融破。
• 特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。
3、超声破碎法
原理： ①利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 ② 超声波使用的频率从1kHz～20kHz， ③间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。 特点： ①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。
• 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。
亲和层析法示意图
正常细胞 标记细胞 标记细胞 加入特异 其它蛋白 SDS-PAGE
＋ 洗滴
被酶裂解 性抗体 洗涤流失 分离蛋白
亲和层析
抗原的鉴定
1.含量鉴定：凯氏定氮法 2.理化性质鉴定
①凝胶层析技术测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③凝胶管状电泳 ④超速离心 3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验