第四节 亲和层析

溴化氰 环氧氯丙烷 双环氧乙烯 丁二烯砜 亚氨二乙酸 用其活化的基质与配体偶联，或用其把基质和配 体螯合起来。前两种适合于含氨基的配体，后三 种用于非生命分子的配体如重金属等，但丁二烯 砜偶联法在碱性溶液中是不稳定的。
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溴化氰偶联法
1. 活化 琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引 入各种适宜的活性基团。 溴化氰(CNBr)活化法是最常用的活化方法之一，活化 过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨 (NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：
B. 剧烈的洗脱条件即蛋白质变性条件：如用盐 酸胍、尿素等洗液洗脱下的蛋白质等生命大 分子物质，需要经过适当的处理方可恢复活 性。
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(六) 亲和层析柱的再生
当洗脱结束后，连续用大量的洗脱液或高浓度的盐 溶液彻底洗涤柱子，再用平衡缓冲液使层析柱重新 平衡。经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二 次亲和层析。一般亲和层析柱都可以反复使用多次。 例如，木瓜蛋白酶的亲和吸附剂(甘氨酰精氨酸-琼
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亲和层析实质：是把具有识别能力的配体L(对
酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以
共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如
活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M-L，前者
叫做固相载体，而固化后的配体仍保持束缚特
异物质的能力。
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当把固相载体装入小层析柱(几毫升到几十毫升 床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。样品 中对配体有亲和力的物质S可借助静电引力、范 德瓦尔力及结构互补效应等作用吸附到固相载体 上，而无亲和力或非特异吸附的物质被缓冲液洗 涤出来，形成第一个层析峰。再改变缓冲液的pH 值或增加离子强度或加入抑制剂等，可把物质S 从固相载体上解离下来，形成了第二个层析峰。 这样就可把有效成分与杂质分开。
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一 基本原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配 体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物 L-S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先 结合，而形成M-L-S复合物。根据L-S之间能可 逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称 为亲和层析法(Affinity Chromatography)。
(2)间接测定法
① 推算法（针对配体）：
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体 与活化琼脂糖偶联后洗涤出来的配体量，即 可大致推算出配体的结合量。
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② 根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可 计算配体的结合量：
两种方法： 1. 是把亲和吸附剂装入小柱内(0.5cm×10cm)，加入过量的欲 分离的大分子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤 剂彻底洗去非专一性的物质，然后再用特异的洗脱剂洗出 欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子物质的量，计
2. 具有与基质共价结合的基团
注意：该基团和基质结合后，对配体与互补
蛋白的亲和力没有影响或影响不明显。
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(三) 亲和吸附剂的制备
将配体偶联到基质上的方法：物理法和化学法
物理法：包埋法和吸附法等； 化学法：交联法和偶联法等。 交联法是用双功能试剂（如戊二醛，碳化二亚 胺）交联基质和配体。
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偶联法的化学试剂：
算出配体的结合量（洗脱量法）。
2. 把少量纯的大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和 平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量（加样量 法）。
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(四) 特异吸附（亲和反应）
当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱 (A)时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零； 当样品不断地通过柱子时，欲分离的大分子物质与配 体之间形成的复合物浓度越来越大，使欲分离的大分 子物质的浓度恒定地增加(B)。 由于配体的存在使欲分离大分子物质的移动受到阻碍， 从而导致产生紧密的复合物带(C)。
质对提高分离效果有利。
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一般亲和吸附剂的基质：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔性的玻 璃珠。 商品纤维素具有不可忽略的吸附性，且结构不均一。 聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖与配体结合后，多孔 性大大降低，同时前者具有大量的酰胺基，不易在 载体和配体之间引入间隔物。
由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖结合成的链状
多糖。
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Sepharose 4B的特点
1. 符合理想基质的五点要求 2. Sepharose极易用溴化氰活化 3. 并易于引入不同的基团，在温和的条件下可连接较 多的配体
4. 容易吸附大分子物质，吸附量较大
5. Sepharose4B的结构比Sepharose 6B的结构疏松，
优点
1）亲和层析的分辨率高。因为将琼脂糖基质装 入上述的小层析柱中，不论加入何种样品液都只 能得到一个层析峰。
2）操作步骤少，活力不易丧失。 适用：分离纯化蛋白质，核酸和激素等物质。 缺点：要分离一种物质必须找到适宜的配体，并 将其制成固相载体。
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二、操 作
(一) 理想基质的五点要求（基质的选择）： 1. 极低的非特异吸附性。
机械强度比Sepharose2B好,
所以是亲和层析中广泛使用的基质。
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(二) 配体的选择
配体的选择需要谨慎。
选择的配体：抑制剂、效应物、酶的辅助因子、
类似底物、抗体和其它物质（如外源凝集素、
染料和金属离子等）等。
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优良的配体应具备两个条件：
1. 与纯化的物质有较强亲和力
注意：配体与大分子物质之间的亲和力太大时，对 分离纯化大分子物质是有害的。
脂糖)在四个月内可重复使用20次。
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三 提高吸附剂的操作容量
影响操作容量的因素： 基质的多孔性；
配体性质； 配体在吸附剂中的含量； 配体与吸附物结合时的位阻效应大小； 操作条件。
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(一) 在配体和基质之间引入“手臂”(arms)
玻璃珠具有多孔性好、机械性能强的特点，但对某 些物质也有一定的吸附力。
交联琼脂糖由于交联后降低了羟基数目，因而导致 配体的结合数目减少。 16
实践中基质：聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、多孔
性玻璃珠和琼脂糖珠(Sepharose 4B)。 目前应用最多的是Sepharose 4B，Sepharose是
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(1)直接测定法
① 2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验: 在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的匀浆液中，加1 毫升饱和硼酸钠溶液、3滴3％2,4,6-三硝基 苯磺酸盐水溶液反应2小时(室温下)。
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不同亲和吸附剂具有不同的颜色：
a. 未发生取代的基质与2,4,6-三硝基苯磺酸盐 反应呈黄色 b. 未取代的肼衍生物(hydrazides)与其反应呈 深红色。 c. 配体为脂肪族氨基衍生物的与其反应呈橙色
可得十分集中的蛋白峰。但是洗脱出的蛋白质液应 立即中和、稀释或透析，以免其活性丧失。
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③
亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液蛋白质 变性剂洗脱。
A. 竞争性洗脱剂：
优点：专一性强，能洗脱出和配体特异结合的大分 子物质。 缺点：需较大体积的洗脱液。 原因：洗脱速度与复合物解离速度相关。当复合 物稳定或具5-15min解离半衰期时，需1小时以上 的时间才能洗脱出吸附物的95％。在柱中加入高 浓度的抑制物停止洗脱，让其保留一段时间，甚 至提高柱温再重新洗脱。可缩短洗脱时间、缩小 39 洗脱体积，提高洗脱物的浓度。
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一般用NaHCO3溶液(pH8.5)或者NaCl-硼酸盐溶液 洗涤(绝不可用带氨基的缓冲液)，除去过剩的溴 化氰。 通过活化反应形成的化合物有两种：一是具有反 应能力的亚氨碳酸盐衍生物，二是无反应能力的 氨基碳酸盐。
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2．与配体偶联
经活化和洗涤过的基质与等体积的0.2- 0.25 mol/L碳酸盐缓冲液(含0.5mol/L NaCl和1-10微 摩尔配体／m1基质溶液，pH8-10）混合、缓慢 搅拌(不用磁力搅拌器)2小时(室温)或搅拌过夜。 以便配体和基质充分偶联而形成固相载体。
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对于偶联极牢固会丧失活性的生物大分子物 质配体，则应在低pH值（pH6-6.5）缓冲液 中反应，或活化基质预先在pH8.3的碱性溶 液中进行适当的水解作用（减少活性基团）， 这样可提高配体的活性，当基质Sepharose 缺乏邻近的羟基基团时，它可形成异脲化合 物。反之则形成亚胺碳酸盐衍生物。
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① 亲和力较小时，可连续使用大体积平衡缓冲液洗脱，
得到迟缓的大分子物质峰。 ② 亲和力一般时， 靠改变缓冲液的性质(如PH或离子 强度，或同时改变两者)使复合物之间的亲和力下降 到可分离的程度。改变pH时，用弱酸或弱碱调节， 阶梯式的pH溶液比单一pH溶液洗脱效果好。前者可
把亲和力不同的物质分开。酸性pH或碱性pH洗脱，
2. 高度的亲水性。亲和吸附剂要易与水溶液中 的生命大分子接近。 3. 有较好的理化稳定性。当配体固化和各种因 素作用时（如pH，离子强度，温度和变性剂 等），基质很少甚至不受影响。
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4. 具有大量的化学基团，能有效的被活化，而且容
易和配体结合。 5. 具有适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定。当分离 物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可提 高结合容量；当分离物与配体亲和力大、或者分 离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基
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蛋白质混合物
与配体结合 的蛋白质
加入的可 溶性配基
基质
配体
没有结合 的蛋白质
专一性结 合蛋白质
非专一性结合蛋 白质
蛋 白 质 浓 度
加入配基
与配体专一性结合 蛋白质
洗脱体积
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固体基质、配体、耦合反应、洗脱
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亲和层析的原理与抗原-抗体、激素-受体和酶底物等特异性反应的机理相类似。每对反应物之 间都有一定的亲和力。正如酶与底物的反应中， 特异的底物(S′)才能和一定的酶（E)结台。产 生复合物（E-S′) —样。在亲和层析中是特异 的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力， 并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同 的是，前者进行反应时，配体(类似底物)呈固相 存在，后者进行反应时，底物呈液相存在。
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(五) 分离大分子物质（洗脱）
从亲和层析柱中洗脱出欲分离大分子物质的过程， 所需要的条件比上样时形成复合物的条件剧烈。 样品通过亲和层析柱后，可用大量的平衡液即起始 缓冲液洗去无亲和力的杂蛋白，或用不同的缓冲液 洗涤去除。最后留在柱上的只有专一吸附的大分子 物质。而洗脱专一吸附的大分子物质的条件，具体 作法可根据亲和力决定。
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在基质和配体偶联后的溶液中，加入预先 用盐酸调节pH为9的乙醇胺溶液，在搅拌 下反应15min，在室温下洗涤吸附剂，以 除去过量的配体。
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3 配体结合量的测定
配体结合量一般是用每毫升或每克贮存胶束缚
配体的量表示的。如用mg/ml表示，虽比较简便，
但相对误差较大。测得的配体结合量可作为决
定亲和吸附剂实际用量的参数。 两种测定法：即直接测定法和间接测定法。
d. 芳香族氨基的衍生物与其反应呈橙红色
根据各种颜色的消光读数(用标准液进行 30 校正)，就可计算出配体的含量。
②根据配体的特性进行测定：
先把配体和基质解离开，再根据配体的特性进 行测定。在相同的条件下，用一定量的配体与 未活化的Sepharose混合液作为空白对照，从而 计算出配体的含量。
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如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体
具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓
冲液进行洗脱，也可将它们分离开。用过的固
相载体经再生处理后，可以重复使用。
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分 类
特异性配体亲和层析法。 配体为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的 类似底物等)，它具较强的吸附选择性和较大的结合 力。 通用性配体亲和层析法。 配体为简单的小分子物质(如金属、染料以及氨基酸 等)，它成本低廉、且有较高的吸wenku.baidu.com容量，通过改善 吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 如：六连续组胺酸配合镍亲和性层析进行重组蛋白质的 纯化。 12
第四节 亲和层析
纯化大分子物质的方法的依据是根据理化特性的差异 性。如果这种差异性较小，要得到纯度稍高的物质， 常需繁琐的操作，需较长时间，而收得率低。随着生 化技术的发展，人们找到了一个有效的分离方法，即
亲和层析法。1967年Axen等发明的用溴化氰活化多糖
凝胶偶联肽和蛋白质的方法，在亲和层析中得到采用， 解决了固相载体的制备问题，这就使酶类等大分子物 质的纯化过程变得较简单、迅速和效率高。目前，它 己得到了广泛的应用。