基因工程--工具酶

6.逆转录酶： AWV (源于鸟成髓细胞白血病病毒)， Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒) 活性： (1)53聚合酶活性 (2) RNaseH活性(Mo-MLV 小,cDNA得率高) 主要用途： (1)反转录cDNA (2) 标记5突出端（补平） (3) 测序
四.连接酶
T4 DNA连接酶 连接：粘端，平端，dsDNA中的切口， 杂交体连接
4bp
HpaⅠ HaeⅢ
C CGG GG CC
5bp Ava Ⅱ
EcoRⅡ
G GWCC
CCWGG
6bp BamHⅠ
SmaⅠ 11bp Bg1Ⅰ 12bp BstXⅠ
G GATTC
CCC GGG GCCNNNN NGGC CCANNNNN NTGC
N=A, T, G, C
五. 限制酶的切割末端
5粘端 （EcoR I） 3粘端 （Pst I） 平端 （Sma I）
六.限制酶产生的末端的连接
1. 匹配粘端: 直接连接 2. 平末端: 万能连接 3. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端 或Klenow补平
七.识别位点与切割方式之间的关系
1.识别不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- A GATCT-C CTAG G- T CTAG A2.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶) eg: BamHI Bg1Ⅱ - A GATCT -G GATCC - T CTAG A -CCTAG G
五.碱性磷酸酶
包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶
(CIP), 虾碱性磷酸酶(SAP)
用途: 去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5磷酸根
六.核酸酶
1.DNA酶
为DNA内切核酸酶,水解单链或双链
用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口
(2)降解DNA
2.RNA酶
内切核糖核酸酶,专用降解RNA
核酸内切酶降解细菌外源DNA,
修饰酶保护自身DNA Arber首次从 E.Coli B菌株中分离出Ⅰ型限制酶EcoB
美Hopkings大学 H.Smith
从流感嗜血菌中分离 Ⅱ型 限制酶
Arber, Smith获得1978 年Nobel奖
二.限制酶系统分类和命名 1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微生 物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定 序列
0, 50, 100mmol/L离子强度
pH7.5-8.0
MgCl2
DTT
激活因子
保护还原性基因
近末端的切割：
eg: AccI GGTCGACC 切不动 CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGACCGG 切不动 eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切 eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开 GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时， 90%切开
1. 温度：一般37C，有例外,如：SmaI 25C， BclI 50C，TaqI 65C 2. 缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl) 3. 时间：1-1.5小时
4. 反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积
5. DNA纯度与构型：
(1）纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA，
EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA
星号反应(Star Activity)
识别专一性下降
eg: EcoRI
EcoRI*
GAATTC
AATT
原因：甘油浓度过高，酶浓度太大，
离子强度不适，pH不适(Ph>8.0)
存在有害试剂(>1%乙 醇, DMSO, 乙二醇)
阳离子变化:Mn++, Co++, Zn++, Cu++代替mg++
酶的灭活
SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸
三.系统命名法
限制性内切酶的命名方法 属名 1字母 (EcoRI) E 种 2字母 co 变种 1字母 R I 序数
(HindIII)H
(BamHI) B
in
am
d
H
III
I
四.一般限制酶的识别特点
1. 大多数是严格的识别顺序，少数可变 2. 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长 3. 多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性
二.聚合酶 1. E. Coli DNA聚合酶
活性:（1）53DNA聚合酶活性 （2）35核酸外切酶活性 （3）53核酸外切酶活性 主要用途：切口平移法标记DNA
3. T4 噬菌体DNA聚合酶 活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow 酶强200倍 用途: 3’突出端切平 4. T7噬菌体DNA聚合酶 活性： 53聚合酶活性很强, 无35外切核酸酶活性 主要用途：修饰后用于测序 5. Taq酶 耐热(75--80 C)的DNA聚合酶专用于PCR
(2)构型：切超螺旋需更多的酶
例: lg DNA, EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI HindⅢ Sal I 2.5U 5U 10U
Nar I
20U
酶单位的定义： 1U：50ul反应体积中，1小时内酶完全切割 1ug DNA所需要的酶量 缓冲液
NaCl
Tris-HCl
工具酶
第四章 工具酶
工具酶
基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成
、连接、切割和修饰的各种酶。
包括：
限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶,
第一节 限制性内切酶
（Restriction Endonuclease） 一. 细菌的限制一修饰现象被发现 瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：
1.加热 2.酚抽提
第二节 修饰酶
一.分类
细菌DNA聚合酶 *E. Coli DNA聚合酶（全酶）
*Klenow酶 T4噬菌体DNA聚合酶 *反转录酶 T4噬菌体DNA聚合酶 末端脱氧核苷酸转移酶 T3噬菌体RNA聚合酶 *测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶
依赖于DNA的RNA聚合酶
限制性内切酶的分类
Ⅰ型: 特异识别、随Βιβλιοθήκη Baidu切割 Ⅱ型：特异识别、同点切割 Ⅲ型：特异识别、异地切割 通常所指的限制酶即Ⅱ类酶
限制酶特性比较
I型 II型 III型 限制与修饰由 同一酶承担 是 否 是 酶反应辅助因子 ATP.mg++ SAM mg++ ATP.mg++SAM 识别位点特性 / 4-6bp回文对称 / 切割位点 距离>1kb 识别点中 距3端24-26bp 举例 EcoB BamHI EcoPL 识别位点 TGAN8TGCT G GATTC AGACC 克隆工作中用途 无 有 无
SP6噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶
连接酶
E. Coli DNA连接 *T4 DNA连接酶 T4噬菌体 RNA连接酶
激酶 磷酸酶 核酸酶
T4噬菌体多核苷酸激酶 *碱性磷酸酶
Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶 RNaseA RNaseT1 DNaseI EXoⅢ 噬菌体外切核酸酶
3.识别相同，切割不同 eg: SmaI XmaI
-CCC GGG-GGG CCCeg: HpaⅡ -CCGG-
-C CCGG
-G GGCC CMsp Ⅰ -C * C GG-
4．识别相同，切割相同──同工酶 同裂酶
-GG CC-
-G G CC-
八.限制酶反应的影响因素