酶免疫组化实验

6、纯丙酮固定20min，双蒸水洗去多余丙 酮，自然干燥。 7、在标本处滴加5%BSA封闭液50ul，室温 封闭10min，甩去多余液体，不洗。 8、滴加鼠抗人CD3单抗50ul，置湿盒中 37℃作用1h。
9、PBS洗3次，每次2min，用吸水纸将细胞 周围擦干。 10、加B-山羊抗小鼠IgG抗体50ul，置湿盒 中37℃作用20min。 11、重复9。 12、加SABC 50ul，置湿盒中37℃作用20min。 13、重复9。
14、加DAB 50ul，室温10～13分钟，双蒸 水洗。（DAB需现配现用，即将A、B、C 液各1滴加入1ml双蒸水中混合） 15、加苏木素染液复染30s。 16、加盖玻片镜检。
五、实验结果判定

阳性细胞染成棕黄色，阴性细胞为淡 蓝紫色，计数100个细胞，并计算出阳 性细胞百分率。

（流式参考：56％～72％）
酶免疫组化技术
微生物与免疫学教研室
实验目的
1、掌握免疫组化技术的基本原理。
2、掌握检测T细胞表面分子CD3的实验原理
及检ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法。 3、掌握SABC免疫放大技术原理。

免疫组织化学技术（immunohistochemistry
technique, IHCT）是指在组织细胞原位通过抗
原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见
实验步骤
1、无菌采集静脉血3ml/2人，注入盛有肝
素的无菌试管中（肝素浓度为20U/ml全
血），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2、用无菌吸管加入等体积即3ml的室温PBS
液，使血液等倍稀释。
3、取10ml试管2支，分别加入1.5ml淋巴细 胞分离液（Ficoll），将离心管倾斜45 角，在距分层液界面上1cm处将稀释血液

ABC法原理
1、预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶
标生物结合，形成可溶的亲和素（或链霉亲和素） -生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。
2、当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）
或生物素化二抗（间接法）相遇时，ABC（或SABC） 中未饱和的亲和素结合部位就可与抗体上的生物 素结合，使抗原-抗体反应与ABC （或SABC）标记 体系连成一体进行检测。
优点
一个亲和素（A）有4个生物素结合位 点，一个过氧化物酶可结合多个生物素分 子，ABC法将亲和素作为“桥”把生物素 化的抗体与生物素结合的酶连接起来，形 成一个网络状复合物，其中网络了大量酶 分子，因此应用于检测体系时，极大提高 酶在抗原-抗体反应中的浓度，提高检测敏 感性。
实验原理




将分离得到的淋巴细胞制成涂片，加入的CD3单克 隆抗体与待检单个核细胞涂片作用。 CD3阳性的细胞就会与CD3单克隆抗体特异性结合， 再用生物素化抗鼠IgG检测CD3单抗与待检细胞结 合的情况。 最后加入链霉亲和素-生物素-过氧化物酶 (ABC桥 联法)，与生物素化抗鼠IgG结合，酶遇到底物时， 能催化底物产生有色不溶性产物。 根据细胞被底物着色的情况可以判定CD3阴性和阳 性的细胞，测定其阳性百分率。
沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管3ml，
注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分
层液内。
4、2000转/分离心30min，离心后另取1只 10ml试管，加入6ml PBS液，用毛细吸 管轻轻插到白膜层，取吸淋巴细胞层至 此试管中，1500转/分离心10min洗涤2 次。 5、第2次洗涤后弃去上清，用移液器将沉 淀细胞和试管壁所剩PBS液（约200ul） 混匀，吸取20ul细胞悬液于洁净载玻片 上，制成涂片，自然干燥。
的标记物，对抗原抗体进行定位、定性和定量
检测的一种免疫检测方法。 抗原抗体反应的特异性 组织化学的可见性
分类

酶免疫组化技术


荧光免疫组化技术
亲和免疫细胞组化技术


免疫金（银）细胞染色组化技术
免疫标记电镜技术 杂交免疫细胞组化技术
酶免疫组化技术

酶免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗
原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在 与否或定位的一类酶免疫技术。 本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例。以亲 和素-生物素-过氧化物酶（ABC或SABC） 技术 检测T淋巴细胞亚群为例验证酶免疫组织化学 技术检测组织抗原的方法。

酶免疫组化染色中常用的酶及显示底物

最常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）

常用的供氢体：
二氨基联苯胺（DAB）—反应产物呈棕色 氨基乙基卡巴唑（AEC）—反应产物呈橘红色 4-氯-1-萘酚—反应产物呈灰蓝色
生物素-亲和素放大技术

是一种以生物素(biotin，B)和亲和素(avidin， AV)具有的多级放大结合特性为基础的实验 技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活 性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等 材料标记，与标记免疫技术的有机结合，极 大提高了分析测定的灵敏度。 特点：灵敏度、特异性、稳定性、适用性 常见类型：BAB法和ABC法
间接ABC法：CD3——鼠抗CD3单抗——B-山羊抗鼠IgG抗体——SABC
SABC
B- 山 羊 抗 鼠 IgG 抗体
T淋巴细胞
鼠抗CD3单抗 CD3
实验器材与试剂
1、5%BSA 2、抗CD3单克隆抗体 3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗) 4、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC) 5、3,3,-二氨基联苯胺(DAB) 6、0.0lmol/L pH7.2PBS 7、淋巴细胞分离液 8、丙酮 9、玻片、吸水纸、显微镜等
实验讨论

影响酶免疫组织化学技术的因素有哪些？

能否用ELISA的酶底物进行免疫组化染色？为
什么？

除了用ABC法技术外，还有那些方法可用于检
测T淋巴细胞亚群？