脂肪酶
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.5试验所用培养基的确定
培养基作为利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，对微生物的生长繁殖、产物积累等有相当大的影响。不同的微生物有适合他们生长的最佳培养基，同时为了获得各种不同的产物，培养基的成分也会有所不同。综合考虑这两个方面，针对杆菌产脂肪酶这一目的，对各种不同的培养基进行了考察研究，产酶结果见表4，从中获取产酶率较高的培养基用于后续研究。
将酶液在pH 9.5条件下，分别于不同温度下保温60 min后，按常规测定剩余酶活力，以40℃下酶液的酶活力为100%。从图7可见，该酶在70℃以下较稳定，高于70℃时，酶活力迅速下降。
5.结论
通过试验对各影响因素进行合理配置可获得较高的产酶率。组合培养基是最适合于杆菌生长并产脂肪酶。由于表面活性剂能改变细胞膜的通透性并改善氧在气液界面的传递速度，因此在培养基中添加某些表面活性剂能提高酶的产量。适宜产酶条件为26℃，初始pH 6.5。脂肪酶最佳反应条件为40℃, pH 9.5；该酶在70℃以下、pH 7.0~10.5范围内稳定，因此在加酶洗衣粉、洗涤剂和制革工业中有良好的应用前景。
参 考 文 献
1刘书来．脂肪酶催化的研究进展[J]．发展论坛，2003,26(4)：16-19.
2高修功．脂肪酶产生菌的选育及产酶条件的优化[J]．微生物学报，1998，38(4)：313—317
3彭立凤，赵汝淇，谭天伟.微生物脂肪酶的应用[J].食品与发酵工业, 2000, 26(3): 68-79.
具体做法如下：在三角瓶中，准确加入以下反应体系：底物1 mL、甘氨酸缓冲液5 mL、蒸馏水3 mL、酶液1 mL，充分混匀，40℃水浴15 min。准确加入无水乙醇10 mL，终止反应，加入酚酞试剂5滴，用0.05 mol/L NaOH标准液滴定。酶活力计算公式：脂肪酶活力(单位/mL)=(V1-V2)×0.05×1000/15
关键词：产酶条件；培养；产酶优化；菌种筛选；酶学特性
1.前言
脂肪酶( lipase) ,又称甘油酯水解酶,是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成 的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统， 即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时， 脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应，这些反应通常具有高底物专一性，区域性或对映选择性，使脂肪酶成为有机合成中重要的生物催化剂。近l0年来，微生物脂肪酶在各种不同行业也得到了广泛的应用，主要是利用脂肪酶的水解和合成反应。首先，脂肪酶水解反应是指脂肪酶催化脂肪或脂水解为其组成脂肪酸和甘油或醇，以此应用脂肪酶的方面及行业包括脂肪水解、脂肪酸提纯、三甘酯结构的测定、皮革生产、纸浆和造纸、加酶洗涤剂、食品成分、医学应用、底纸脱墨等；其次，应用脂肪酶合成作用的包括低中相对分子质量脂、聚脂、手性化合物的合成、油脂改性、药物和化妆品等。本文对脂肪酶菌种来源、脂肪酶的培养、产酶条件的优化以及酶学性质的研究进展作一综述。
式中：V1一试料溶液滴定值；V2一对照滴定值；0.05一标准NaOH摩尔量(mol/L)
2.4筛选方法
2.4.1优势脂肪酶产生菌的筛选
以实验室菌株的相关参数为依据，通过测定各自在最适反应条件下的产酶率及生长情况等指标，以确定较合适的研究对象。方法如下：将筛选菌种用培养基，配制后灭菌冷却，在超净工作台上接入各菌株一环，在各自的最适培养条件下，用200 r／min的恒温式摇床培养，60 h后取样测定酶活并观察菌体生长情况。
4.3酶的pH稳定性
将酶溶液分别置于不同的pH环境中，40℃保温60 min，然后按常规测定剩余酶活力.以pH9.5及40℃条件下的酶活力为100，图6的结果表明，在pH 7.0~10.5范围内，酶活力可保持在起始值的70以上。可见，该酶在加酶洗衣粉及洗涤剂工业中有良好的应用价值。
4.3酶的热稳定性
3.2氮源对脂肪酶产生的影响
以1%的植物油为碳源，分别选用玉米浆、豆饼粉、蛋白胨、酵母汁等单一或复合氮源进行产酶实验，实验结果如表5所示。可以看出，3%的玉米浆或3%蛋白胨加1%酵母汁的复合氮源产酶效果相当，酶活力高达55 IU/ml。利用廉价的玉米浆作为氮源，在大规模工业生产中具有重要意义。
3.3培养温度对产酶的影响
4Hou C T, Johson T. Screening of Lipase Activities with Cultures from ARS Culture Collection [J]. Am. Oil Chem. Soc., 1992,69: 1088-1097.
5Pooja Rathi, Saxena R K, Rani Gupta. A Novel Alkaline Lipase from Burkholdderia Cepacia for Detergent Formulation [J].Process Biochem., 2001, 37: 187-192.
图1显示了不同温度下进行的产酶实验结果，可以看出，26℃是ZJU-02的适宜产酶温度。
3.4初始pH对产酶的影响
在26℃及不同培养液初始pH值条件下进行产酶实验，定期取样测定发酵液中的脂肪酶活力。图2为不同条件下获得的最高酶活力比较，其中初始pH值为6.5时，酶活力最高。
3.5培养时间对产酶的影响
图3是ZJU-02在26℃，pH 6.5, 200 r/min条件下摇瓶中的典型产酶进程.图中显示,发酵72 h时酶活力最大，达86 IU/ml。这一结果已达到同类文献报道的先进水平，显示了良好的开发前景。
由表4，可以明显看到不同的培养基对杆菌产脂肪酶有较大的影响。可以看出，组合培养基是最适合于杆菌生长并产脂肪酶的一种培养基，因此，将组合培养基作为条件优化的研究培养基。
3.产酶条件的优化
3.1碳源对脂肪酶产生的影响
选用葡萄糖、植物油、动物油、淀粉、蔗糖等单一或复合碳源进行产酶实验.从表5可以看出，油脂作为碳源有利于产酶，酶活力高达54 IU/ml。油脂除作为碳源外，显然还对脂肪酶的形成具有诱导作用，但油的种类对产酶影响不大。
3.6表面活性剂对产酶的影响
由于表面活性剂能改变细胞膜的通透性并改善氧在气液界面的传递速度，因此在培养基中添加某些表面活性剂能提高酶的产量。本实验考察了4种表面活性剂及其不同浓度对产酶的影响。以不加表面活性剂的发酵液酶活力为100%，相对酶活力为加表面活性剂与不加表面活性剂的酶活比。实验中观察到菌体生长情况无明显变化。从表6可以看出Tween 80对产酶有一定的促进作用，使酶产量提高了27%。
2.4.2实验所用培养基的筛选
设定各培养基(见表2)，配制各培养基，加塞灭菌，在无菌操作台上接入优势菌各一环，恒温式摇床200r／min，同步培养60h，取样测定酶活。
2.4.3产生菌产酶的单因素条件(碳源、氮源、无机盐)筛选
确定培养基中的其他组分不变，仅对单一的因素条件进行种类替换，并进行试验，同步培养60 h后，取样测定酶活。由表3可以看出，在各自最适培养条件下，各菌种在酶活，表观现象上，表现各不相同。就酶活方面，在60 h后，杆菌表现了较强的产酶能力，酶活高达l9．53 U／mL；在表观现象上，浑浊度和乳白色现象，也可以指示产酶能力的大小。
脂肪酶的研究
摘 要
对脂肪酶产生菌进行了筛选，并对优势菌株杆菌的产酶条件进行研究。研究包括培养基细成(碳源、氮源、无机盐)、初始pH值等影响因素，获得了较为优化的脂肪酶产酶条件，获得的最大酶活。最佳培养条件为温度26℃、初始pH 6.5。脂肪酶活力可高达86 IU/ml.酶在70℃以下、pH 7.0~10.5范围内稳定；酶反应的适宜温度为40℃，适宜pH为9.5.该酶制剂在洗涤剂和制革工业中有良好的应用前景。
2.3脂ຫໍສະໝຸດ Baidu酶活力的测定方法
底物采用乳化系统：三羧酸甘油酯于2％聚乙烯醇溶液以1：3比例混合后，高速均浆，成为乳白色均匀稳定的乳化液；缓冲液采用0．05 mol/L的甘氨酸缓冲液。随着脂肪酶的作用，对底物进行分解，用碱滴定游离脂肪酸，求得脂肪酶的活力；在测定条件下，以每分钟分解底物释放出1µmol游离脂肪酸所需的酶量定义为一个脂肪酶活力单位(U)。
4.酶学性质
4.1酶反应最适pH
以橄榄油为底物，测定不同pH值条件下的脂肪酶活力，以测得的最高酶活力为100%，结果(图4)表明，酶作用的最适pH为9.5，pH 8.5~10.5范围内酶活力保持80%以上，可见该脂肪酶是碱性的。
4.2酶反应最适温度
在pH 9.5的环境中，将酶液置于不同温度下反应30 min，结果表明(图5)，该酶最适反应温度为40℃，30~60℃范围内酶活力保持在80%以上。
6宋庆训，林金萍，戎一平，等.脂肪酶产生菌Candida rugosa产酶条件研究[J].生物工程学报, 2001, 17(1): 101-104.
7李孱，白景华，蔡昭铃，等．细菌素发酵培养基的优化及动力学初步分析[J]．生物工程学报，2001，17(2)：187—192．
2.脂肪酶的培养
2.1供试菌种
杆菌、球菌、霉菌、酵母菌均为实验室自行筛选获得，仅做镜下形态分类。培养基筛选优势产生菌用培养基：三羧酸甘油脂2％；NH4NO40.3％；CaC120.02％；KH2PO40．1％；MgS04*7H20 0.05％；NaCl 0.05％。
2.2培养条件
50mL培养基装于250 mL三角瓶中，恒温式摇床200 r/min，培养60 h。
培养基作为利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，对微生物的生长繁殖、产物积累等有相当大的影响。不同的微生物有适合他们生长的最佳培养基，同时为了获得各种不同的产物，培养基的成分也会有所不同。综合考虑这两个方面，针对杆菌产脂肪酶这一目的，对各种不同的培养基进行了考察研究，产酶结果见表4，从中获取产酶率较高的培养基用于后续研究。
将酶液在pH 9.5条件下，分别于不同温度下保温60 min后，按常规测定剩余酶活力，以40℃下酶液的酶活力为100%。从图7可见，该酶在70℃以下较稳定，高于70℃时，酶活力迅速下降。
5.结论
通过试验对各影响因素进行合理配置可获得较高的产酶率。组合培养基是最适合于杆菌生长并产脂肪酶。由于表面活性剂能改变细胞膜的通透性并改善氧在气液界面的传递速度，因此在培养基中添加某些表面活性剂能提高酶的产量。适宜产酶条件为26℃，初始pH 6.5。脂肪酶最佳反应条件为40℃, pH 9.5；该酶在70℃以下、pH 7.0~10.5范围内稳定，因此在加酶洗衣粉、洗涤剂和制革工业中有良好的应用前景。
参 考 文 献
1刘书来．脂肪酶催化的研究进展[J]．发展论坛，2003,26(4)：16-19.
2高修功．脂肪酶产生菌的选育及产酶条件的优化[J]．微生物学报，1998，38(4)：313—317
3彭立凤，赵汝淇，谭天伟.微生物脂肪酶的应用[J].食品与发酵工业, 2000, 26(3): 68-79.
具体做法如下：在三角瓶中，准确加入以下反应体系：底物1 mL、甘氨酸缓冲液5 mL、蒸馏水3 mL、酶液1 mL，充分混匀，40℃水浴15 min。准确加入无水乙醇10 mL，终止反应，加入酚酞试剂5滴，用0.05 mol/L NaOH标准液滴定。酶活力计算公式：脂肪酶活力(单位/mL)=(V1-V2)×0.05×1000/15
关键词：产酶条件；培养；产酶优化；菌种筛选；酶学特性
1.前言
脂肪酶( lipase) ,又称甘油酯水解酶,是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成 的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统， 即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时， 脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应，这些反应通常具有高底物专一性，区域性或对映选择性，使脂肪酶成为有机合成中重要的生物催化剂。近l0年来，微生物脂肪酶在各种不同行业也得到了广泛的应用，主要是利用脂肪酶的水解和合成反应。首先，脂肪酶水解反应是指脂肪酶催化脂肪或脂水解为其组成脂肪酸和甘油或醇，以此应用脂肪酶的方面及行业包括脂肪水解、脂肪酸提纯、三甘酯结构的测定、皮革生产、纸浆和造纸、加酶洗涤剂、食品成分、医学应用、底纸脱墨等；其次，应用脂肪酶合成作用的包括低中相对分子质量脂、聚脂、手性化合物的合成、油脂改性、药物和化妆品等。本文对脂肪酶菌种来源、脂肪酶的培养、产酶条件的优化以及酶学性质的研究进展作一综述。
式中：V1一试料溶液滴定值；V2一对照滴定值；0.05一标准NaOH摩尔量(mol/L)
2.4筛选方法
2.4.1优势脂肪酶产生菌的筛选
以实验室菌株的相关参数为依据，通过测定各自在最适反应条件下的产酶率及生长情况等指标，以确定较合适的研究对象。方法如下：将筛选菌种用培养基，配制后灭菌冷却，在超净工作台上接入各菌株一环，在各自的最适培养条件下，用200 r／min的恒温式摇床培养，60 h后取样测定酶活并观察菌体生长情况。
4.3酶的pH稳定性
将酶溶液分别置于不同的pH环境中，40℃保温60 min，然后按常规测定剩余酶活力.以pH9.5及40℃条件下的酶活力为100，图6的结果表明，在pH 7.0~10.5范围内，酶活力可保持在起始值的70以上。可见，该酶在加酶洗衣粉及洗涤剂工业中有良好的应用价值。
4.3酶的热稳定性
3.2氮源对脂肪酶产生的影响
以1%的植物油为碳源，分别选用玉米浆、豆饼粉、蛋白胨、酵母汁等单一或复合氮源进行产酶实验，实验结果如表5所示。可以看出，3%的玉米浆或3%蛋白胨加1%酵母汁的复合氮源产酶效果相当，酶活力高达55 IU/ml。利用廉价的玉米浆作为氮源，在大规模工业生产中具有重要意义。
3.3培养温度对产酶的影响
4Hou C T, Johson T. Screening of Lipase Activities with Cultures from ARS Culture Collection [J]. Am. Oil Chem. Soc., 1992,69: 1088-1097.
5Pooja Rathi, Saxena R K, Rani Gupta. A Novel Alkaline Lipase from Burkholdderia Cepacia for Detergent Formulation [J].Process Biochem., 2001, 37: 187-192.
图1显示了不同温度下进行的产酶实验结果，可以看出，26℃是ZJU-02的适宜产酶温度。
3.4初始pH对产酶的影响
在26℃及不同培养液初始pH值条件下进行产酶实验，定期取样测定发酵液中的脂肪酶活力。图2为不同条件下获得的最高酶活力比较，其中初始pH值为6.5时，酶活力最高。
3.5培养时间对产酶的影响
图3是ZJU-02在26℃，pH 6.5, 200 r/min条件下摇瓶中的典型产酶进程.图中显示,发酵72 h时酶活力最大，达86 IU/ml。这一结果已达到同类文献报道的先进水平，显示了良好的开发前景。
由表4，可以明显看到不同的培养基对杆菌产脂肪酶有较大的影响。可以看出，组合培养基是最适合于杆菌生长并产脂肪酶的一种培养基，因此，将组合培养基作为条件优化的研究培养基。
3.产酶条件的优化
3.1碳源对脂肪酶产生的影响
选用葡萄糖、植物油、动物油、淀粉、蔗糖等单一或复合碳源进行产酶实验.从表5可以看出，油脂作为碳源有利于产酶，酶活力高达54 IU/ml。油脂除作为碳源外，显然还对脂肪酶的形成具有诱导作用，但油的种类对产酶影响不大。
3.6表面活性剂对产酶的影响
由于表面活性剂能改变细胞膜的通透性并改善氧在气液界面的传递速度，因此在培养基中添加某些表面活性剂能提高酶的产量。本实验考察了4种表面活性剂及其不同浓度对产酶的影响。以不加表面活性剂的发酵液酶活力为100%，相对酶活力为加表面活性剂与不加表面活性剂的酶活比。实验中观察到菌体生长情况无明显变化。从表6可以看出Tween 80对产酶有一定的促进作用，使酶产量提高了27%。
2.4.2实验所用培养基的筛选
设定各培养基(见表2)，配制各培养基，加塞灭菌，在无菌操作台上接入优势菌各一环，恒温式摇床200r／min，同步培养60h，取样测定酶活。
2.4.3产生菌产酶的单因素条件(碳源、氮源、无机盐)筛选
确定培养基中的其他组分不变，仅对单一的因素条件进行种类替换，并进行试验，同步培养60 h后，取样测定酶活。由表3可以看出，在各自最适培养条件下，各菌种在酶活，表观现象上，表现各不相同。就酶活方面，在60 h后，杆菌表现了较强的产酶能力，酶活高达l9．53 U／mL；在表观现象上，浑浊度和乳白色现象，也可以指示产酶能力的大小。
脂肪酶的研究
摘 要
对脂肪酶产生菌进行了筛选，并对优势菌株杆菌的产酶条件进行研究。研究包括培养基细成(碳源、氮源、无机盐)、初始pH值等影响因素，获得了较为优化的脂肪酶产酶条件，获得的最大酶活。最佳培养条件为温度26℃、初始pH 6.5。脂肪酶活力可高达86 IU/ml.酶在70℃以下、pH 7.0~10.5范围内稳定；酶反应的适宜温度为40℃，适宜pH为9.5.该酶制剂在洗涤剂和制革工业中有良好的应用前景。
2.3脂ຫໍສະໝຸດ Baidu酶活力的测定方法
底物采用乳化系统：三羧酸甘油酯于2％聚乙烯醇溶液以1：3比例混合后，高速均浆，成为乳白色均匀稳定的乳化液；缓冲液采用0．05 mol/L的甘氨酸缓冲液。随着脂肪酶的作用，对底物进行分解，用碱滴定游离脂肪酸，求得脂肪酶的活力；在测定条件下，以每分钟分解底物释放出1µmol游离脂肪酸所需的酶量定义为一个脂肪酶活力单位(U)。
4.酶学性质
4.1酶反应最适pH
以橄榄油为底物，测定不同pH值条件下的脂肪酶活力，以测得的最高酶活力为100%，结果(图4)表明，酶作用的最适pH为9.5，pH 8.5~10.5范围内酶活力保持80%以上，可见该脂肪酶是碱性的。
4.2酶反应最适温度
在pH 9.5的环境中，将酶液置于不同温度下反应30 min，结果表明(图5)，该酶最适反应温度为40℃，30~60℃范围内酶活力保持在80%以上。
6宋庆训，林金萍，戎一平，等.脂肪酶产生菌Candida rugosa产酶条件研究[J].生物工程学报, 2001, 17(1): 101-104.
7李孱，白景华，蔡昭铃，等．细菌素发酵培养基的优化及动力学初步分析[J]．生物工程学报，2001，17(2)：187—192．
2.脂肪酶的培养
2.1供试菌种
杆菌、球菌、霉菌、酵母菌均为实验室自行筛选获得，仅做镜下形态分类。培养基筛选优势产生菌用培养基：三羧酸甘油脂2％；NH4NO40.3％；CaC120.02％；KH2PO40．1％；MgS04*7H20 0.05％；NaCl 0.05％。
2.2培养条件
50mL培养基装于250 mL三角瓶中，恒温式摇床200 r/min，培养60 h。