紫杉醇发酵生产工艺

微生物发酵生产紫杉醇

产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜 类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的 抗癌药物之一 ？。紫杉醇最早是wanj 等于

1971 年从短枝红豆杉(7lkusbreviifolia) 树

皮中分离得到的。随后， schiff 等证实 紫杉

醇具有独特的抗癌机制。随着紫杉醇 的临床应

用，对其研究也逐渐深入，其主 要抗癌机制为

抑制肿瘤细胞的微管 (Microtllbules) 合成，

以 阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；

的作用，可调节机体的免疫功能。目前国际市

场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合 成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。

紫杉醇的工业生产受到了 原料和技术两方面的制约， 短期内难以突破。为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日 益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，

包括化学全合成、红豆杉细胞培养 及微生物发酵。微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，

其研究和开发越来越受到国内外 研究学者的广泛关注。

这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇， 该法首先将杉醇 纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中， 运用代谢工程手段生产紫杉醇。

创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，

以及调控系列克隆至大 肠杆菌，让其表达，此过程刚被 Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事实现，而运用代谢工程手 段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。

国内外研究：

1、 分离菌种：最早stierle 和strobel 等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生

紫杉醇，定名为安德列亚霉。此后， 各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作， 陆续 从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、 中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内 生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。周东坡领导的课题组从百年以上的东北

红豆杉的枝条与树皮中分离到 3株可产紫杉醇的内生真菌，发酵液中紫杉醇的产量可达 51.06 卩g/L 〜125. 70卩g/L 。王建锋等也从南方红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢菌，发酵产物分 析表明可产紫杉醇，产量为 185. 4卩g/L 。

2、 菌种改良：

诱变：HQD33(周东坡分离)经过紫外线、

EMS 60co 、NTG?诱变剂顺序诱变得到高产突变

株NCEUH1,其紫杉醇产量到达 314. 07卩g/L 。

原生质体融合：赵凯等人发现最佳的诱变条件为 30w 紫外灯、30cm

距离、照射50s; UV+Licl 复合 诱变、照射时间40s 。

3、构建工程菌：紫杉醇的生物合成途径为

最近Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事通过平 衡数

种细菌和植物的酶来利用大肠杆菌发酵产

kKUUKI-A£.IOfi -dld 另外还有类似脂多糖(IPS) 紫杉醇还可诱导细胞凋亡,

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物紫杉二烯，其产量为 ig/L.

工艺流程:

、产紫杉二烯工程菌构建:

表达质粒的构建与诱导表达 ------------ ►工程菌的培养与目标产物分离

基因文库的构建：取欧洲紫杉醇提取染色体 目标基因的获得：取得合成紫杉二烯酶的结构基因及调控系列 扩增质粒的构建：将紫杉二烯酶的结构基因及调控系列连接到质粒上

二、大肠杆菌发酵生产紫杉二烯:

废水处理 培养基原料：大肠杆菌发酵液 质量标准

主要活性成分：5 3, 20-环氧-1 , 2 a, 4, 7 3, 10 3, 13 a -六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4, 10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13 — [(2' R, 3' S) -N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。按干燥品计算， 含 C47H51NO14 应为 98.0 — 102.0%。

性状：白色结晶性粉末，无臭，无味。在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中

几乎不溶。比旋度 取本品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每

1ml 中含3mg 的溶液， 依法测定，比旋度为 -48°至 -56°。

鉴别：（ 1）取与紫杉醇对照品，分别加甲醇制成每

1ml 中的含 1.0mg 的溶液，照薄层色谱 法（试验，吸取上述两种溶液各 10卩I,分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯

-氯仿-甲醇-三乙胺（4 ： 3 : 2 : 1 ： 1 ）为展开剂，展开后，晾干，喷以

10%硫酸乙醇溶液， 在105C 加热10分钟后检视，显紫黑色斑点，供试品溶液所显主斑点的颜色和位置应与对 照品溶液的主斑点相同。

（2） 在含量测定项下所记录的色谱图中,供试品溶液主成分峰的保留时间应与对照品溶液

主成分峰的保 ______ ►扩增质粒的构建

重组DNA 导入宿主细胞 ______________ ►

培养基原料 +培养基配制 ■+培养基灭菌

工程菌 *种子罐 *生产罐 +培养液 *细胞分离

三、 通过基因工程手段调整高产紫杉醇酵母产紫杉醇的途径, 紫

杉醇，构建工程菌

四、 酵母发酵生产紫杉醇 使它能利用紫杉二烯高效合成

培养基原料 ＞培养基配制

工程菌 •摇瓶 4种子罐 +生产罐 +培养液 *细胞分离 *无细胞上清液 *产品抽提 产品精制 *产品包装

留时间一致。

（3）红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致。

经济效益：产量为 2mg/L

建十只十立方米的发酵罐

产值 2*10*10*365/1000*400000=2920000$

各种杂费为 1460000$[3]

利润： 1460000$

参考文献：[1]Isoprenoid Pathway Optimization for TaxoI Precursor Overproduction in Escherichia coIi

[2]IsoIation and characterization of endophytic taxoI-producing fungi from Taxus

chinensis

[3] A review: recent advances and future prospects of taxoI-producing endophytic fungi

[4] 微生物发酵生产紫杉醇研究进展

[5]TaxoI biosynthesis