应用微生物学2_PPT幻灯片
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真核基因无SD序列，翻 译时缺少16S核糖体的 结合位点
真核蛋白质易被细菌蛋 白酶降解而得不到产物
对策
用cDNA克隆的策略或 用RT-PCR获得基因， 即不含内含子
将真核基因克隆在原核 启动子的下游，以利用 SD序列
用蛋白酶缺陷型宿主或 克隆蛋白酶抑制剂基因， 或使产生融合蛋白然后 再加工成所需蛋白
感受态细胞转化
感受态：细胞处于一种特殊的生理状态，在这种状态 下可以吸收外源DNA。
感受态的出现：（1）一种可扩散的感受态因子的存在； （2）细胞外层的一些组分，如膜蛋白等状态的变化。
有些细胞在生长的某一阶段会自发出现感受态，但基 因工程中所用的微生物在正常培养条件下不会自发出 现感受态，需要经过人工的特殊处理。
转化效率
卫星菌落
受体菌
基因工程受体菌的要求
有能有效接受外源DNA的手段（转化、感染、结合…） 外源DNA能忠实地进行复制（一般应是 rec-, r-, m-） 有利于基因操作与生产的性状（鉴别、生长、分泌、
后处理等） 生物学安全性（不在人体内生存，不在非培养条件下
生存，不易转移等）
安全受体菌E.coli X1776
terminator
Pribnow box 转录开始
回文序列
结合位点
RNA 聚合酶：’
：识别，：保持构型，：起始催化，’ ：与DNA模板结 合
SD序列：Shine-Dalgarmo box，富含AT(Tm低)，翻译时mRNA与核 糖体16sRNA结合位点
真核基因的表达
问题
真核基因有内含子，一 起转录后得到错误翻译 产物
CI:编码使噬菌体不能复制的阻遏蛋白，噬菌斑混浊，插 入后CI失活，噬菌斑透亮
取代型载体
λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有2个酶切 位点，DNA重组时外源DNA将取代这2个位点间的片段。
EcoR I
EcoR I
SupE
整个基因组缺失27%，可插入 3-18 kb
SupE，抑制基因，抑制LacZ基因的amber突变体，在X-gal 平板上产生蓝色噬菌斑,取代后噬菌斑无色
酸、甲硫氨酸等 cycA1,cycB2-环丝氨酸抗性，便于监视，自然界几乎没有兼抗nal、cyc两种药物的 Rfb-2-粗糙突变体，对胆汁酸、离子去污剂、抗生素敏感 hadR2-对外源DNA无限制作用
启动子
TTGACA -35 RNA 聚合酶() 识别位点
TATAAT 结构基因
-10 SD序列
头尾合成
重组区
N CI 调节区
EcoRI P Q S R cos 复制区 裂解区
J-N为非必须区，与噬菌体生长及噬斑形成无关，可被消除 或取代，当λ-DNA分子大小为其全长的78%-108%(38~52 kb)时， 可以形成感染性噬菌体颗粒。
λ 噬菌体类载体的构建
用突变、缺失等方法，减少限制酶的切割位点，除去 必须区内的限制酶位点。
酿酒酵母系统
酿酒酵母系统的特点
可食、安全，适用于药品生产 遗传背景最清楚的真核细胞 在简单培养基中生长迅速、细胞密度高 基因操作容易 可分泌胞外蛋白 可正确表达真核基因产物
pUC质粒
Ap抗性 LacOZ中有多克隆位点
(MCS)，可在X-gal平板 上直接挑选
5溴,4氯,3吲哚－β－半乳糖苷 （无色）
β－半乳糖苷酶
（蓝色）
第三代质粒载体
pBR322（复制原点，抗药性） T-噬菌体启动子、Lac启动子 多克隆位点
His尾
穿梭质粒
质粒一般只能在特定的寄主中复制，能 穿梭于不同寄主中复制的质粒称为穿梭 质粒。
EcoR I
S I
ligase
在非必须区内进行基因操作，切除一定的DNA片断， 有目的的引入一些DNA片断。
插入型载体
λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有一个酶 切位点，DNA重组时外源DNA将在这个位点插入。
EcFra Baidu bibliotekR I
b538
CI
imm434
整个基因组缺失18%，最大插入为 9 kb
大肠杆菌系统的成熟性，带来了穿梭质 粒载体使用上的方便性。
λ 噬菌体类载体
可容纳的较大的外源DNA片段 进入细菌细胞容易 能裂解宿主细胞，提取容易 组建的DNA或cDNA文库易于长期保存
λ噬菌体基因组
双链DNA,48502bp,50基因
(12bp)cos A F J att int rec
λ噬菌体载体与外源DNA重组
粘粒(cosmid)载体
插入外源DNA片断的大小： 质粒：<10kb 噬菌体：10-20kb 粘粒：40kb
粘粒(5-10kb): COS+抗药性基因+限制酶单切位点
粘粒 限制酶酶切 连接外源DNA(ligase) 体外包装（需要2 株带λ溶源突变体的E.coli，冻融后提取包装所需的各种蛋白质） 感染受体细胞
F- -无性因子 tonA53-抗噬菌体T1、T5、Ф80 dapD8-二氨基庚二酸缺陷型 minA1, minA2-产微细胞 supE42-限制质粒任意转移，只要质粒上有amber突变，则只能在有amber突变抑制基因的
宿主中复制 40[gal-uvrB]-作为受体转化能力增强 λ– -无λ噬菌体 nalA25-萘啶酮酸抗性，便于监视 thyA57-胸腺嘧啶缺陷型，与dap一起，无dap、thy时易死亡，使DNA更易分解 29[bioH-asd]-生物素缺陷-天冬氨酸半醛缺陷，中间有不能利用甘油、麦芽糖、需要苏氨
大肠杆菌的感受态转化
过程： 细胞培养至对数前期冷冻离心收集细胞CaCl2浓缩 冰浴再
冷DN冻A离混心合收冰集浴细胞热冲击CaC选l2再择浓性缩平4板°C3放7 置°C培感养受态细胞与
机制： 二价阳离子(Ca Ba Sr Mg)改变了细胞膜结构，使之在低
温时能与DNA结合，热脉冲使结合在膜上的DNA有0.1%-1%可 以抗DNase，并使抗DNase的 DNA进入细胞。
大肠杆菌系统
大肠杆菌系统的特点 载体
质粒载体 噬菌体载体 粘粒(cosmid)载体
受体 感受态(competance)细胞转化
大肠杆菌系统的特点
基因工程是从大肠杆菌系统发展起来的 生长迅速 技术成熟 基因组测序完成
大肠杆菌系统的质粒载体
第一代质粒载体：pBR322 第二代质粒载体： pUC质粒 第三代质粒载体
真核蛋白质易被细菌蛋 白酶降解而得不到产物
对策
用cDNA克隆的策略或 用RT-PCR获得基因， 即不含内含子
将真核基因克隆在原核 启动子的下游，以利用 SD序列
用蛋白酶缺陷型宿主或 克隆蛋白酶抑制剂基因， 或使产生融合蛋白然后 再加工成所需蛋白
感受态细胞转化
感受态：细胞处于一种特殊的生理状态，在这种状态 下可以吸收外源DNA。
感受态的出现：（1）一种可扩散的感受态因子的存在； （2）细胞外层的一些组分，如膜蛋白等状态的变化。
有些细胞在生长的某一阶段会自发出现感受态，但基 因工程中所用的微生物在正常培养条件下不会自发出 现感受态，需要经过人工的特殊处理。
转化效率
卫星菌落
受体菌
基因工程受体菌的要求
有能有效接受外源DNA的手段（转化、感染、结合…） 外源DNA能忠实地进行复制（一般应是 rec-, r-, m-） 有利于基因操作与生产的性状（鉴别、生长、分泌、
后处理等） 生物学安全性（不在人体内生存，不在非培养条件下
生存，不易转移等）
安全受体菌E.coli X1776
terminator
Pribnow box 转录开始
回文序列
结合位点
RNA 聚合酶：’
：识别，：保持构型，：起始催化，’ ：与DNA模板结 合
SD序列：Shine-Dalgarmo box，富含AT(Tm低)，翻译时mRNA与核 糖体16sRNA结合位点
真核基因的表达
问题
真核基因有内含子，一 起转录后得到错误翻译 产物
CI:编码使噬菌体不能复制的阻遏蛋白，噬菌斑混浊，插 入后CI失活，噬菌斑透亮
取代型载体
λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有2个酶切 位点，DNA重组时外源DNA将取代这2个位点间的片段。
EcoR I
EcoR I
SupE
整个基因组缺失27%，可插入 3-18 kb
SupE，抑制基因，抑制LacZ基因的amber突变体，在X-gal 平板上产生蓝色噬菌斑,取代后噬菌斑无色
酸、甲硫氨酸等 cycA1,cycB2-环丝氨酸抗性，便于监视，自然界几乎没有兼抗nal、cyc两种药物的 Rfb-2-粗糙突变体，对胆汁酸、离子去污剂、抗生素敏感 hadR2-对外源DNA无限制作用
启动子
TTGACA -35 RNA 聚合酶() 识别位点
TATAAT 结构基因
-10 SD序列
头尾合成
重组区
N CI 调节区
EcoRI P Q S R cos 复制区 裂解区
J-N为非必须区，与噬菌体生长及噬斑形成无关，可被消除 或取代，当λ-DNA分子大小为其全长的78%-108%(38~52 kb)时， 可以形成感染性噬菌体颗粒。
λ 噬菌体类载体的构建
用突变、缺失等方法，减少限制酶的切割位点，除去 必须区内的限制酶位点。
酿酒酵母系统
酿酒酵母系统的特点
可食、安全，适用于药品生产 遗传背景最清楚的真核细胞 在简单培养基中生长迅速、细胞密度高 基因操作容易 可分泌胞外蛋白 可正确表达真核基因产物
pUC质粒
Ap抗性 LacOZ中有多克隆位点
(MCS)，可在X-gal平板 上直接挑选
5溴,4氯,3吲哚－β－半乳糖苷 （无色）
β－半乳糖苷酶
（蓝色）
第三代质粒载体
pBR322（复制原点，抗药性） T-噬菌体启动子、Lac启动子 多克隆位点
His尾
穿梭质粒
质粒一般只能在特定的寄主中复制，能 穿梭于不同寄主中复制的质粒称为穿梭 质粒。
EcoR I
S I
ligase
在非必须区内进行基因操作，切除一定的DNA片断， 有目的的引入一些DNA片断。
插入型载体
λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有一个酶 切位点，DNA重组时外源DNA将在这个位点插入。
EcFra Baidu bibliotekR I
b538
CI
imm434
整个基因组缺失18%，最大插入为 9 kb
大肠杆菌系统的成熟性，带来了穿梭质 粒载体使用上的方便性。
λ 噬菌体类载体
可容纳的较大的外源DNA片段 进入细菌细胞容易 能裂解宿主细胞，提取容易 组建的DNA或cDNA文库易于长期保存
λ噬菌体基因组
双链DNA,48502bp,50基因
(12bp)cos A F J att int rec
λ噬菌体载体与外源DNA重组
粘粒(cosmid)载体
插入外源DNA片断的大小： 质粒：<10kb 噬菌体：10-20kb 粘粒：40kb
粘粒(5-10kb): COS+抗药性基因+限制酶单切位点
粘粒 限制酶酶切 连接外源DNA(ligase) 体外包装（需要2 株带λ溶源突变体的E.coli，冻融后提取包装所需的各种蛋白质） 感染受体细胞
F- -无性因子 tonA53-抗噬菌体T1、T5、Ф80 dapD8-二氨基庚二酸缺陷型 minA1, minA2-产微细胞 supE42-限制质粒任意转移，只要质粒上有amber突变，则只能在有amber突变抑制基因的
宿主中复制 40[gal-uvrB]-作为受体转化能力增强 λ– -无λ噬菌体 nalA25-萘啶酮酸抗性，便于监视 thyA57-胸腺嘧啶缺陷型，与dap一起，无dap、thy时易死亡，使DNA更易分解 29[bioH-asd]-生物素缺陷-天冬氨酸半醛缺陷，中间有不能利用甘油、麦芽糖、需要苏氨
大肠杆菌的感受态转化
过程： 细胞培养至对数前期冷冻离心收集细胞CaCl2浓缩 冰浴再
冷DN冻A离混心合收冰集浴细胞热冲击CaC选l2再择浓性缩平4板°C3放7 置°C培感养受态细胞与
机制： 二价阳离子(Ca Ba Sr Mg)改变了细胞膜结构，使之在低
温时能与DNA结合，热脉冲使结合在膜上的DNA有0.1%-1%可 以抗DNase，并使抗DNase的 DNA进入细胞。
大肠杆菌系统
大肠杆菌系统的特点 载体
质粒载体 噬菌体载体 粘粒(cosmid)载体
受体 感受态(competance)细胞转化
大肠杆菌系统的特点
基因工程是从大肠杆菌系统发展起来的 生长迅速 技术成熟 基因组测序完成
大肠杆菌系统的质粒载体
第一代质粒载体：pBR322 第二代质粒载体： pUC质粒 第三代质粒载体