限制性片段长度多态性

雌激素受体(ESR)基因存在多态性。
李凤娥等(2000) 利用PCR技术,检测了不同品种猪的ESR 基因多态性,结果表明品种间基因频率差异极显著( P<0.01)
多态性：指在一个生物群体中，同时和经常存在两 种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或 等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。
DNA片段长度多态性（FLP）:由于单个碱基的缺 失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化, 而导致DNA片段长度的变化.又称限制性片段长度 多态性,这是一类比较普遍的多态性。
国内外9个产仔数差异较大的猪品种
PCR-RFLP 相关知识
CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites) CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCRRFLP）技术。
1.2 组织DNA提取 猪耳组织DNA的提取采用常规的饱和酚/氯仿抽提取 (Sambrook等,1999)。
1.3 引物合成
设计引物参照Short 等(1997) 的方法进行,由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物序列为:
F : 5′-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3′
概述： 用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入
或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理 ，以检测其多态性。
原理：
PCR扩增
PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切
酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。
R: 5′-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTA G-3
1.4 PCR扩增
PCR 扩增体系(25 μ L):
DNA模板(100ng/μ L)1μ L,10×Buffer(含Mg2)2.5μ L
dNTP混合物(各2.5mmol/L)2μ L,引物(5 pmoL/L)各1.4μ L
Taq酶(5U/μ L)0.2μ L,加灭菌蒸馏水补足至25μ L 。 PCR反应程序为: 94℃预变性4min;94℃变性1min,55℃复 性30s ,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸7min,最后放入 4℃保存备用。
6.8μ L ,置37℃恒温
反应
4h后经8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析。
扩增产物的PCR-RFLP分析
PCR-RFLP结果 如图所示
图2 ESR基因PCR-RFLP 检测结果
9个不同猪种中ESR基因第5外显子基因型及其等位基因频率
表1 不同猪种ESR基因 Pvu-Ⅱ酶切后等位基因频率分布
猪种 数量
国内地方猪种
20
14
16
国外猪种
9
8
10
枫泾猪
苏太猪
二花脸
注：猪形体大小表示产仔个数的多与少
杜洛克
约克夏
皮特兰
1994年美国Rothschild研究组发现 雌激素受体(ESR)基因是猪控制产仔数的主效基因
雌激素与妊娠密切相关其功能受到雌激素受体(ESR) 基因的调控。
国内外已有一些学者对ESR基因多态性与产仔数相关性 进行了研究，Short等(1997)应用PCR-RFLP 法研究结果 发现：B等位基因与产仔数存在显著正相关,与背膘厚、日 采食量、乳头数存在弱的负相关,且不影响生长速度,因此 是一种较理想的标记。
基因型频率（个体数）
基因频率
杜洛克 24
AA 0.875（21）
AB 0.125（3)
BB 0. 000 (0)
A 0. 938
B 百度文库. 062
约克夏 44 0.540（24）
0. 386 (17)
0. 074 (3) 0. 733 0. 267
皮特兰 20 0.550（11）
0. 450 (9)
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不同猪种 ESR基因多态性的 PCR-RFLP 分析
小组成员：
谭静雯 王柏勇 吴海锋 吴宇文 冼玉敏 徐紫君
于洁 曾兴民 郑奔宜 周佳 邹永基
组长 ：
谭静雯
报告人：
吴海锋（优游清风）
说明
上下各组报告中的ppt制作、介绍讲解如有雷同， 1 纯属巧合，不胜荣幸。
报告以第一人称表示。但无任何侵权抄袭行为， 2 不负任何法律责任。
不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条
带。
限制性片段长度多态性（PFLR）
限制性内切酶消化获得的DNA片段大
小的变异
780bp 470bp 310bp
得到
PCR-RFLP
基本流程
根据基因 名称查询
序列 设计引物
提取基因组 DNA
PCR 扩增
限制性内切酶 消化
电泳分离 EB染色或银染
3 感谢主办此次报告会的老师。
teamwork
感谢所有在场同学朋友们， 4 报告如有纰漏，
容稍后交流探讨。
• 繁殖性状是猪育种的重要目标之一，不同品种猪 在繁殖力这一重要的经济性状上存在较大差异,产
仔数的提高会大大提高商品肉猪的产量，给现代 养猪生产带来巨大的经济效益。
不同猪种
初产8头以上，经产9头以上
扩增结果
本研究扩增的ESR基因第5外显子片段长度应为120bp左右,PCR扩增产物 经1%的琼脂糖检测结果见 图1
图1 ESR 基因PCR扩增产物
1.5 RFLP检测
选用PvuⅡ对PCR产物进行消化,酶切反应总体系为10 μ L ,其中
PCR扩增产物2.5μ L,限制性内切酶
0.2L(1H02UO/μ L),10×Buffer0.5μ L,dd
长白猪 产仔数初产9头杜以洛上克，经产10头以上
二花脸
初产平均12头，经产平均16头以上，三胎以上，每胎可产20头
梅皮山特猪兰
每胎产仔数10头左右
每胎产仔16头，最高记录一胎产崽33头
约克夏
初 产
8 头 以 上 ， 经 产
9 头 以 苏太猪 经产平均产仔14-26头上
国内外猪种一般产仔数粗略比较
试验过程展述
试验材料
1.1 试验动物
杜洛克猪、长白猪、约克夏猪的样品均采自常州市康乐农牧有限公司 梅山猪、二花脸猪、枫泾猪、苏太猪的样品采自江苏省苏州市苏太猪育种中心 荣昌猪的样品采自重庆市畜牧科学研究院荣昌猪试验场 每个个体采耳组织块约1.0g ,放入 1.5 mL的Eppendorf管内于冰盒中送回实验室 备用