中性粒细胞功能测定

实验一、中性粒细胞吞噬功能测定Assay for Phagocytosis of Polymorphonuclear Leukocyte 【实验目的】

•掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理；

•熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的操作方法；•通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

【实验原理】

血液中的中性粒细胞通称小吞噬细胞，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力，在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。计数吞噬率和吞噬指数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。

【材料和试剂】

1.待测样本新鲜抗凝静脉血

2.被吞噬物灭活白色葡萄球菌菌液（6×108/ml）。

3.试剂无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。

4.器材EP管，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒

温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。

【操作步骤】

1.白色葡萄球菌液制备。（已制备好）

2.待测血标本制备：静脉采血5ml。

3.在EP管内加40微升血液，20微升菌液，混匀。

4.将EP管置37℃温育30min，每隔10min混匀一次。

5.取一小滴上述混合液，置于载玻片上，推成薄血片，晾干。

6.甲醇固定4-5min，滴加瑞氏-吉姆萨染液A液2-3滴，染色1-

2min，再B液2-3滴，染色5-10min，水洗，晾干。

7.油镜下计数中性粒细胞(＞100个)、吞噬的细菌总数。

【推血片方法】

取血混合液一小滴，放于载玻片的右端。将推片置于血滴前端，与载玻片接触，成30°～40°角 向后拉动推片，使与血液接触 •待血液扩散形成一条线之后，以均速轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载玻片上而形成一薄膜。

取两张无油脂的洁净玻片，左手拇指及中指夹持载玻片，右手持推片。 30°

血滴越大，速度越快、角度越大--血膜越厚

良好的血片，血液应分布均匀，厚度适当。对光观察时呈霓红色，血膜应位于玻片的中央，血膜两端留有空隙，以便注明病

例编号、日期等。

【油镜的使用】

•保护：双手取显微镜，一手握臂，一手托底•对光：升聚光器→打开光栅→反光镜采光•观察：标本固定载物台上→

低倍镜找到标本→

玻片滴香柏油→

换油镜→

目镜观察→细调至图像清晰

•使用完毕立即用擦镜纸擦干镜头上的油

Eosinophil Basophil Monocyte

Neutrophil Platelet RBC

Lymphocyte 胞核 胞质 直径 形状 染色质粗糙不匀，排列紧密 丰富，含较多细小均匀的紫红色中性颗粒 10-15um 为RBC 两倍 中性粒细胞 充满粗大均匀的桔红色嗜酸性颗粒 13-15um ，略大于WBC 圆形 嗜酸性粒细胞 少，常呈淡红，含少量粗大不均匀紫黑色嗜碱性颗粒 10-12um ，略小于中性粒细胞 圆形 嗜碱性粒细胞 大，不规则。染色质疏松如网状 丰富，染淡蓝，含大量细小嗜天青颗粒，可见空泡 15-25um ，最大 圆形或不规则形 单核细胞 圆形，偶见凹陷，染色质粗糙致密

很少，有的仅在核的一侧出现少量蓝色胞浆 6-10um 淋巴细胞 【血细胞的鉴别】

【结果判断】

计数200个中性粒细胞，分别记录吞噬细菌的细胞数和每个中性粒细胞吞入的细胞数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数

吞噬率＝×100% 200

200个中性粒细胞中吞噬细菌的总数

吞噬指数＝×100% 200

美兰染色

【注意事项】

1.所用器材要清洁。

2.如细菌数太多可增加稀释倍数作平皿培养后计数。

3.血膜必须充分干燥，否则在染色过程中易脱落。

4.染液不可过少，以防止蒸发干燥，沉着于血片上不易冲掉。

5.冲洗时应以流水将染液冲去，不可先倒掉染液，以免染料

沉着于血膜上。

6.越接近推片末梢，细胞数越多。计数时应取玻片前、中、

后三段计数，以提高准确率。

【思考题】

1.简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理。

2.该实验过程中应注意哪些事项？

3.检测白细胞功能的实验还有哪些，各有什么特点？