副溶血性弧菌

MR:阳性 （红色） 左侧为阴性 对照
VP：阴性
五、抗原的特征
O抗原是耐热的菌体抗原，目前有O1~O13共
13种，可用于血清学鉴定。 K抗原是一种荚膜抗原，现有K1~K71，也用于 血清学鉴定。 中国大陆副溶血弧菌大部分是O3：K6。
六、检验实验
目前副溶血性弧菌的检验采用国标法（GB/T 4789.7—2013 ）
2、增菌
（1）定性检测
将制备好的 1:10 样品匀液于 36 ℃±1℃培养 8 h～18 h。
（2）定量检测
•用无菌吸管吸取
1:10 样品匀液 1 mL，注入含有 9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备 1:100 的样品匀液。 •另取 1 mL 无菌吸管，按之前操作程序，依次制备 10 倍系 列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支 1 mL 无菌吸 管。 •根据对检样污染情况的估计，选择 3 个适宜的连续稀释度， 每个稀释度接种 3 支含 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管， 每管接种 1 mL。置 36℃±1℃恒温箱内，培养 8 h～18 h。
革兰染色阴性需氧菌,无芽孢，两端有 浓染现象，其中间着色较淡或不着色。
菌体形态呈多型性，主 要出现的形态有球状、 球杆状、卵圆状和丝状。
三、培养特性



1、需氧菌，需氧性很强，营养要求不高。 2、在含盐3～3.5%培养基中生长最好，无盐 条件下不能生长。 3、最适温度30~37℃，PH7.4~8.0。 4、不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂 抵抗力弱。
四、生化特性
能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉和阿 拉伯胶糖，产酸，不产气。不发酵乳糖、蔗 糖、纤维二糖等。 从患者样品中分离的致病菌株在人或家兔红 细胞的培养基中生长，能产生β溶血。 海水中及海产品中分离的菌株不溶血，这个 现象称为“神奈川现象”。能在神奈川培养 基上产生β溶血者，称为神奈川实验阳性。
4.纯培养
挑取三个或以上可疑菌落，划线3 ％氯化钠 胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃ 土l ℃ 培养 18h--24h.
5.初步鉴定
氧化酶试验
挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌 为氧化酶阳性。
涂片镜检
将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副 溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形 态，无芽胞，有鞭毛.

副 溶 血 性 弧 菌 的 生 化 性 状
试验项目 革兰氏染色镜检 氧化酶 动力 蔗糖 葡萄糖 甘露醇 分解葡萄糖产气 乳糖 硫化氢 赖氨酸脱羧酶 VP ONPG 阳性：+
结果 阴性，无芽孢 + + + + + 阴性：-

3 ％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变 黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色 加深。
典型的副溶血性弧菌在TCBS琼脂培养基呈圆形、 半透明、表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触， 有类似口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。


注：TCBS中文名：硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂培养基。
成分：酵母粉 5.0 , 蛋白胨10.0, 硫代硫酸钠10.0, 枸橼酸钠10.0, 牛胆粉5.0, 牛胆酸钠3.0 , 蔗糖20.0 , 氯化钠10.0, 柠檬酸铁1.0 , 麝香草酚兰0.04, 琼脂15.0, pH值8.6 ± 0.1,
3﹪氯化钠三糖铁琼脂
挑取纯培养的单个可疑菌落，转种 3%氯化钠三糖铁琼 脂斜面并穿刺底层，36 ℃±1 ℃培养 24 h观察结果。副 溶血性弧菌在 3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄 不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。
嗜盐性实验
6.确定鉴定
取纯培养物分别接种含
3%氯化钠的甘露醇试 验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP 培 养基，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h 后观察结 果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行 ONPG 试验。 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴 定系统。
嗜盐性试验
MR 试验方法
MR试验方法：取一种细菌的24h
培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培 养基中，置37℃培养48～72h，取 出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养 液呈红色者为阳性，以‘‘十”表 示；橙色者为可疑，以“±”表示； 黄色者为阴性，以“—”表示。
VP试验方法

VP试验方法 ： 取一种细菌的24h纯培养 物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置 37'C培养48～72h取出后在培养液中先加 VP试剂甲液0.6mL，再加乙液0.2mL，充 分混匀。静置在试管架上，15min后培养 液呈红色者为阳性，以“ ”表示；不变色 为阴性，以“—”表示。1h后可出现假阳 性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养 液中混合，静置，强阳性者约5min后就可 产生粉红色反应。
典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上呈圆
形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径 2mm--3 mm.
注：显色培养基成分：特殊营养物质（75.0 g/L）、混合显色剂（2.3g/L）、琼 脂（15.0g/L）。显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底 物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基。
在液体培养基中，呈现浑浊，表面形 成菌膜，R型菌发生沉淀。 在固体培养基上的菌落通常为隆起， 圆形，稍混浊，不透明，表面光滑湿润， 传代之后出现不圆整、粗糙型菌落，或灰 白色半透明或不透明的菌落。 在血琼脂平板上菌落的周围可见溶血 环，某些菌株可形成β溶血或α溶血。
本菌在伊红美兰琼脂上 不生长，某些菌株在麦 康凯上生长，生长的菌 落呈圆形，平坦、半透 明或浑浊，略带红色。
预防措施


1、动物性食品应煮熟煮透再吃。 2、注意海鲜是否干净、新鲜，食前应用淡水 反复冲洗，吃时煮熟煮透，再加适量食醋； 3、生熟食品分开存放，装海产品的器具及接 触海产品的手应洗净擦干再接触其他食品。
二、基本情况及特征
大小：0.7~1.0μm，有时有丝状菌体，可长达15 μm 特征：一端有鞭毛，运动活泼，菌周有鞭毛
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b) 冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃； c) 恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃； d) 均质器或无菌乳钵； e) 天平：感量 0.1 g； f) 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm； g) 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或 微量移液器及吸头； h) 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL、1000 mL； i) 无菌培养皿：直径 90 mm； j) 全自动微生物生化鉴定系统； k) 无菌手术剪、镊子。
副 溶 血 性 弧 菌 检 验 程 序
1.样品制备 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在25℃不超过18小时解冻。非冷冻而易腐蚀的样品 应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置710℃冰箱保存，在24h内检验。 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃.贝 类取全部内容物,包括贝肉和体液,甲壳类取整 个动物，或者动物的中心部分,包括肠和鳃。 以无菌操作取检样25g（或ml），加人3％氯 化钠碱性蛋白栋水225ml，用旋转刀片式均质器 以8000r/min取均质1min，或拍击式均质器拍击 2min，制备成1：10的均匀稀释液。如无均质器， 则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放500mL的 灭菌容器内,加225ml 3%氯化钠碱性蛋白胨水， 并充分振荡。
副溶血性弧菌
Vibrio parahaemolyticus
目录
一、引起疾病症状（致病性、流行病学情况） 二、基本情况及特征 三、培养特性
四、生化特性
五、抗原特征
六、检验方法（举例阐述检验某一食品、商品中该菌的
详细操作过程）
一.副溶血性弧菌疾病症状


副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus）， 进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐 菌食物中毒。 副溶血弧性菌常导致肠胃不适，伴随食物中毒 等症状。表现为急性肠胃炎，腹痛、吐泻、发 烧等特征。少数重症者引起原发性败血症。
嗜盐性试验


挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种 0%、 6%、8%和 10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养 24 h，观察液体混浊情况。 副溶血性弧菌在无氯化钠和 10%氯化钠的胰胨 水中不生长或微弱生长，在 6%氯化钠和 8%氯 化钠的胰胨水中生长旺盛。
10％ NaCl
6％NaCL
ONPG试验





β -半乳糖苷酶试验（ONPG试验）简介 （1）β -半乳糖苷酶试验原理：有的细菌可产生β -半乳糖苷 酶，能分解邻-硝基酚-β -D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻 -硝基酚，在很低浓度下也可检出。 （2）试剂：0.75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在 加入缓冲液（6.9g NaH2P04溶于45ml蒸馏水中，用30% NaOH调整 pH为7.0，再加水至50ml）5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液为无 色，如出现黄色，则不应再用。 （3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成 菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水 浴5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。 （4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min 内显色。 （5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而 不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的 快速鉴定。
副溶血性弧菌的发现



于1950年10月从日本大阪市，发生的一起咸 沙丁鱼食物中毒，患者肠道排泄物和食物中首 次分离出副溶血性弧菌。 在日本，副溶血性弧菌食物中毒约占细菌性食 物中毒的70%～80%.1958年上海市防疫站也从 烤鸭所致食物中毒的患者中分离出此菌。以后 在我国、日本、印度、美国等许多国家均陆续 报道有本病的发生。 1966年国际弧菌命名委员会正式命名为副溶血 性弧菌。
伊红美蓝琼脂培养基主要成分：蛋白胨、乳 糖、磷酸氢二钾、伊红、美蓝、琼脂粉、蒸 馏水。 麦康凯培养基：蛋白胨 17g，脙胨 3g，猪 胆盐(或牛、羊胆盐) 5g，氯化钠 5g，琼脂 17g，蒸馏水 1000mL，乳糖 10g，0.01%结 晶紫水溶液 10mL，0.5%中性红水溶液 5mL
在SS平板上，菌落中等大小，长出1～2mm扁 平、无色、半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈 粘稠状。



1、传染源 传染源为病人，集体发病时往往仅少 数病情严重者住院，而多数未住院者可能成为传染 源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌 迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成广泛流行。 2、传播途径 本病经食物传播，主要的食物是海 产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼 等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而 致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。 3、易感者 男女老幼均可患病，但以青壮年为多， 病后免疫力不强，可重复感染。本病多发生于夏秋 沿海地区，常造成集体发病。近年来沿海地区发病 有增多的趋势。
培养基和试剂
3％氯化钠碱性蛋白胨水 、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆 盐-蔗糖（TCBS）琼脂、3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼 脂 、3％氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验培养基、3 ％氯化钠甘露醇试验培养基、3％氯化钠赖氨酸脱羧 酶试验培养基、3％氯化钠 MR-VP 培养基、3％氯 化钠溶液 、我妻氏血琼脂、 氧化酶试剂、 革兰氏 染色液 、ONPG 试剂、Voges-Proskauer（V-P） 试剂、 弧菌显色培养基、生化鉴定试剂盒。
3.分离
a.对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面 以下 1 cm 内沾取一环增菌液，于 TCBS 平板或弧 菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块 平板。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 b.典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形、半透明、 表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香 糖的质感，直径 2 mm～3 mm。从培养箱取出 TCBS 平板后，应尽快（不超过 1 h）挑取菌落或标记要 挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养 基上的特征按照产品说明进行判定。
中毒食品主要是海产品鱼、虾、蟹、贝类和海
藻等海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋 类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原 因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染．
Fra Baidu bibliotek
副溶血性弧菌致病性

致病因子： 1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素 2、耐热相关溶血素TRH，与TDH 相似。
副溶血性弧菌的流行病学