第八章 甘油发酵20081118
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第八章
甘油发酵
大连大学生物工程学院 二00八年十一月
甘油发酵生产现状
应用领域：广泛用于化工、医药、化妆品、 应用领域：广泛用于化工、医药、化妆品、 食品加工和日常生活等诸多方面，约在2000多 食品加工和日常生活等诸多方面，约在 多 种产品中含有甘油成分。 种产品中含有甘油成分。 生产方法：天然油脂皂化和水解；丙烯氯 生产方法 ：天然油脂皂化和水解 丙烯氯 化法和丙烯氧化法 ；微生物发酵法 微生物发酵法
两种方法
源自文库
亚硫酸盐法: 亚硫酸盐法: 将亚硫酸氢钠(NaHSO3)加入发酵液中，能与乙醛发 生加成反应，生成难溶的结晶状产物，使乙醛不能再 作为受氢体，迫使NADH+H+ 用于磷酸二羟丙酮的还 原，生成甘油 碱法甘油发酵: 碱法甘油发酵: 酵 母 酒 精 发 酵 的 发 酵 液 pH 值 调 至 碱 性 ， 保 持 在 pH7.6以上，则2分子乙醛之间发生歧化反应，1分 子被还原成乙醇，1分子被氧化成乙酸。乙醛失去 了作为受氢体的作用，NADH+H+ 只好用于还原磷 酸二羟丙酮，并生成甘油
2ATP 2CO2 NaHSO3 ↑ ↑ ↓ 2ATP 3-磷酸甘油醛→→ 丙酮酸→乙醛→ 乙醛加 磷酸甘油醛→→ 丙酮酸→乙醛→ 磷酸甘油醛 ↑ 成物 Pi G →→ 1，6-二磷酸果糖 2H ， 二磷酸果糖 EMP途径 EMP途径 磷酸二羟丙酮
α-磷酸甘油
甘油
酵母菌的Ⅲ 二、碱法甘油发酵(酵母菌的Ⅲ型发酵 酵母菌的 型发酵)
甘油+Pi 甘油
当有了乙醛作为受氢体，代谢途径的流向就不再朝甘油方向了。 当有了乙醛作为受氢体，代谢途径的流向就不再朝甘油方向了。
思考题：甘油高产发酵的代谢调控要点 思考题： 将受氢体乙醛除去，则势必造成发酵液中甘油的积累。 将受氢体乙醛除去，则势必造成发酵液中甘油的积累。 是什么？ 是什么？
酵母菌的Ⅱ 一、亚硫酸盐法甘油发酵(酵母菌的Ⅱ型发酵 酵母菌的 型发酵)
1986年和 年和1989年德国明斯特大 年和 年德国明斯特大 学的Bisping等先后利用固定化酿酒 等先后利用固定化酿酒 学的 酵母， 酵母，半连续间歇发酵和间歇流加发 酵生产甘油， 1990年用耐高渗透压 酵生产甘油 ， 年用耐高渗透压 毕赤氏酵母实现了半连续间歇流加发 酵法生产甘油，产量达 酵法生产甘油，产量达86g/L。 。
我国与国外差距 （1）残糖高，…… ）残糖高， （2）规模化较少，…… ）规模化较少， 市场构成与西方发达国家差异 中国：涂料， 中国：涂料，49%；医药食品，10% ；医药食品， 美国：涂料， 美国：涂料，10%；医药食品，＞ 54% ；医药食品，＞
目前我国的甘油供需缺口很大 ， 2005年甘油需求超过 万吨，其中进口 年甘油需求超过10万吨 年甘油需求超过 万吨， 约 6万吨 ， 随着我国以甘油为原料生产 万吨， 万吨 1,3-丙二醇的大力发展 ， 预计到 丙二醇的大力发展， 预计到2010年 丙二醇的大力发展 年 我国甘油的需求将达到20万吨以上。 我国甘油的需求将达到 万吨以上。 万吨以上
（2）耐高渗透压酵母好氧发酵法 ）
（3）影响发酵的因素 ） 随生产菌种和原料的变化， 随生产菌种和原料的变化，影响甘油产率 和菌种发酵速度的因素可归纳为： 、 源的 和菌种发酵速度的因素可归纳为 ： C、 N源的 种类和配比，金属盐的选择，发酵温度，pH及 种类和配比，金属盐的选择，发酵温度， 及 通风量的确定等。 通风量的确定等。
第一节
甘油发酵生产菌种
绝大多数为酵母菌。 绝大多数为酵母菌。 1945年Nicherson等筛选出产酸结合 年 等筛选出产酸结合 酵母， 酵母 ， 1958年 Peterson发现柳氏结合酵 年 发现柳氏结合酵 年报道木兰球拟酵母I2B2只产甘 母，1960年报道木兰球拟酵母 年报道木兰球拟酵母 只产甘 油而无其他副产物， 油而无其他副产物 ， 1960年Dawson研究 年 研究 了用耐高渗透压酵母连续生产甘油的新工 艺，受到人们的高度重视。 受到人们的高度重视。
甘油发酵（酵母的第Ⅱ型发酵） 甘油发酵（酵母的第Ⅱ型发酵）
利用糖酵解途径进行甘油发酵
酒精发酵之初： 酒精发酵之初：
CNADH +H
即：
+
α-磷酸甘油脱氢酶 磷酸甘油脱氢酶
α-磷酸甘油 磷酸甘油
磷酸二羟丙酮+NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 磷酸甘油+H α-磷酸甘油 2O 磷酸甘油
磷酯酶
α-磷酸甘油 磷酸甘油+NAD+ 磷酸甘油
好氧发酵
适当好氧条件下， 适当好氧条件下 ， 糖酵解产生的丙酮酸可以通过 TCA循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油 循环来增加其产能水平，一方面减少 循环来增加其产能水平 磷酸甘油 醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例； 醛向乙醛方向进行 ， 增加底物向产物转化的比例 ； 另 一方面，增加了细胞能量水平 ， 减少了细胞的死亡率 ， 一方面 ， 增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率， 有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。但是， 有利于提高发酵的速率 ， 缩短发酵周期 。 但是 ， 这种 有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA循环的同时， 循环的同时， 有限的好氧发酵 ， 使得丙酮酸进行 循环的同时 也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物的产生， 循环过程中的许多中间性产物的产生， 也增加了 循环过程中的许多中间性产物的产生 这对于甘油的提取带来了不利的影响。 这对于甘油的提取带来了不利的影响。
三、发酵法甘油生产过程
1、原料 、 淀粉质、 淀粉质、糖质和纤维质 。 2、工艺路线 、 （1）厌氧亚硫酸盐法 ） 所用原料为淀粉质或糖蜜、 所用原料为淀粉质或糖蜜、亚硫酸钠及其 他营养盐。 他营养盐。培养基灭菌后冷却降温接入酿酒酵 母 ， 于 30～ 32℃ 控温发酵 ～ 3d， 发酵液即可 ～ ℃ 控温发酵2～ ， 进入提取阶段回收甘油。 进入提取阶段回收甘油。
例子： 例子：利用热冲击处理技术来提高甘油的产量
背景： 背景： （1）酵母在比常规发酵温度髙 ～20℃的温度下经 ）酵母在比常规发酵温度髙10～ 受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。 受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。 （2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压耐受 ） 发现热冲击能提高细胞对盐渗透压耐受 力 发现热冲击可使胞内3－ （3）Toshiro发现热冲击可使胞内 －磷酸甘油脱氢 ） 发现热冲击可使胞内 酶的活力提高15～ ％， ％，并导致甘油产量提高 酶的活力提高 ～25％，并导致甘油产量提高
实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的， 实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因 此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量 正交条件A 正交条件 冲击温度 （℃ ） 40，45，50 ， ， B 开始时机（h） 开始时机（ ） 8，16，30 ， ，
C 冲击时间（分） 15，30，60 冲击时间（ ， ， 结果发酵16小时， ℃冲击30分钟最佳 发酵96 分钟最佳， 结果发酵 小时，45℃冲击 分钟最佳，发酵 小时 小时后甘油浓度提高32.6％， ％， 小时后甘油浓度提高
第二节
甘油发酵工艺
厌氧条件下， 厌氧条件下 ， 酵母大量的将葡萄糖转 变成乙醇，而产物中只有很少的甘油， 变成乙醇，而产物中只有很少的甘油，在 酵母菌的其他厌氧发酵产品中（白酒、 酵母菌的其他厌氧发酵产品中（白酒、葡 萄酒、黄酒等） 甘油的含量也很少。 萄酒、黄酒等），甘油的含量也很少。
酒精发酵（酵母的第Ⅰ型发酵） 酒精发酵（酵母的第Ⅰ型发酵） alcoholic fermation
甘油合成机制
酵母在一定条件下培养， 酵母在一定条件下培养，可以利用糖分生成甘油 加入亚硫酸氢钠， 加入亚硫酸氢钠 ， 与乙醛 起加成作用 生成难溶的乙 醛亚硫酸氢钠加成物
酵母的第二型发酵
厌氧甘油发酵缺点
菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生； 菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生； 转化率较低，按照上述能量平衡计算， 转化率较低，按照上述能量平衡计算，糖与 甘油的转化率不可能超过50%，加上酵母增殖需 甘油的转化率不可能超过50% 50 要消耗一部分糖，发酵液中残留一部分糖， 要消耗一部分糖 ， 发酵液中残留一部分糖 ， 实 际转化率远低于50% 际转化率远低于50%，导致了厌氧发酵生产甘油 50 的成本较高。 的成本较高。
甘油发酵
大连大学生物工程学院 二00八年十一月
甘油发酵生产现状
应用领域：广泛用于化工、医药、化妆品、 应用领域：广泛用于化工、医药、化妆品、 食品加工和日常生活等诸多方面，约在2000多 食品加工和日常生活等诸多方面，约在 多 种产品中含有甘油成分。 种产品中含有甘油成分。 生产方法：天然油脂皂化和水解；丙烯氯 生产方法 ：天然油脂皂化和水解 丙烯氯 化法和丙烯氧化法 ；微生物发酵法 微生物发酵法
两种方法
源自文库
亚硫酸盐法: 亚硫酸盐法: 将亚硫酸氢钠(NaHSO3)加入发酵液中，能与乙醛发 生加成反应，生成难溶的结晶状产物，使乙醛不能再 作为受氢体，迫使NADH+H+ 用于磷酸二羟丙酮的还 原，生成甘油 碱法甘油发酵: 碱法甘油发酵: 酵 母 酒 精 发 酵 的 发 酵 液 pH 值 调 至 碱 性 ， 保 持 在 pH7.6以上，则2分子乙醛之间发生歧化反应，1分 子被还原成乙醇，1分子被氧化成乙酸。乙醛失去 了作为受氢体的作用，NADH+H+ 只好用于还原磷 酸二羟丙酮，并生成甘油
2ATP 2CO2 NaHSO3 ↑ ↑ ↓ 2ATP 3-磷酸甘油醛→→ 丙酮酸→乙醛→ 乙醛加 磷酸甘油醛→→ 丙酮酸→乙醛→ 磷酸甘油醛 ↑ 成物 Pi G →→ 1，6-二磷酸果糖 2H ， 二磷酸果糖 EMP途径 EMP途径 磷酸二羟丙酮
α-磷酸甘油
甘油
酵母菌的Ⅲ 二、碱法甘油发酵(酵母菌的Ⅲ型发酵 酵母菌的 型发酵)
甘油+Pi 甘油
当有了乙醛作为受氢体，代谢途径的流向就不再朝甘油方向了。 当有了乙醛作为受氢体，代谢途径的流向就不再朝甘油方向了。
思考题：甘油高产发酵的代谢调控要点 思考题： 将受氢体乙醛除去，则势必造成发酵液中甘油的积累。 将受氢体乙醛除去，则势必造成发酵液中甘油的积累。 是什么？ 是什么？
酵母菌的Ⅱ 一、亚硫酸盐法甘油发酵(酵母菌的Ⅱ型发酵 酵母菌的 型发酵)
1986年和 年和1989年德国明斯特大 年和 年德国明斯特大 学的Bisping等先后利用固定化酿酒 等先后利用固定化酿酒 学的 酵母， 酵母，半连续间歇发酵和间歇流加发 酵生产甘油， 1990年用耐高渗透压 酵生产甘油 ， 年用耐高渗透压 毕赤氏酵母实现了半连续间歇流加发 酵法生产甘油，产量达 酵法生产甘油，产量达86g/L。 。
我国与国外差距 （1）残糖高，…… ）残糖高， （2）规模化较少，…… ）规模化较少， 市场构成与西方发达国家差异 中国：涂料， 中国：涂料，49%；医药食品，10% ；医药食品， 美国：涂料， 美国：涂料，10%；医药食品，＞ 54% ；医药食品，＞
目前我国的甘油供需缺口很大 ， 2005年甘油需求超过 万吨，其中进口 年甘油需求超过10万吨 年甘油需求超过 万吨， 约 6万吨 ， 随着我国以甘油为原料生产 万吨， 万吨 1,3-丙二醇的大力发展 ， 预计到 丙二醇的大力发展， 预计到2010年 丙二醇的大力发展 年 我国甘油的需求将达到20万吨以上。 我国甘油的需求将达到 万吨以上。 万吨以上
（2）耐高渗透压酵母好氧发酵法 ）
（3）影响发酵的因素 ） 随生产菌种和原料的变化， 随生产菌种和原料的变化，影响甘油产率 和菌种发酵速度的因素可归纳为： 、 源的 和菌种发酵速度的因素可归纳为 ： C、 N源的 种类和配比，金属盐的选择，发酵温度，pH及 种类和配比，金属盐的选择，发酵温度， 及 通风量的确定等。 通风量的确定等。
第一节
甘油发酵生产菌种
绝大多数为酵母菌。 绝大多数为酵母菌。 1945年Nicherson等筛选出产酸结合 年 等筛选出产酸结合 酵母， 酵母 ， 1958年 Peterson发现柳氏结合酵 年 发现柳氏结合酵 年报道木兰球拟酵母I2B2只产甘 母，1960年报道木兰球拟酵母 年报道木兰球拟酵母 只产甘 油而无其他副产物， 油而无其他副产物 ， 1960年Dawson研究 年 研究 了用耐高渗透压酵母连续生产甘油的新工 艺，受到人们的高度重视。 受到人们的高度重视。
甘油发酵（酵母的第Ⅱ型发酵） 甘油发酵（酵母的第Ⅱ型发酵）
利用糖酵解途径进行甘油发酵
酒精发酵之初： 酒精发酵之初：
CNADH +H
即：
+
α-磷酸甘油脱氢酶 磷酸甘油脱氢酶
α-磷酸甘油 磷酸甘油
磷酸二羟丙酮+NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 磷酸甘油+H α-磷酸甘油 2O 磷酸甘油
磷酯酶
α-磷酸甘油 磷酸甘油+NAD+ 磷酸甘油
好氧发酵
适当好氧条件下， 适当好氧条件下 ， 糖酵解产生的丙酮酸可以通过 TCA循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油 循环来增加其产能水平，一方面减少 循环来增加其产能水平 磷酸甘油 醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例； 醛向乙醛方向进行 ， 增加底物向产物转化的比例 ； 另 一方面，增加了细胞能量水平 ， 减少了细胞的死亡率 ， 一方面 ， 增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率， 有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。但是， 有利于提高发酵的速率 ， 缩短发酵周期 。 但是 ， 这种 有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA循环的同时， 循环的同时， 有限的好氧发酵 ， 使得丙酮酸进行 循环的同时 也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物的产生， 循环过程中的许多中间性产物的产生， 也增加了 循环过程中的许多中间性产物的产生 这对于甘油的提取带来了不利的影响。 这对于甘油的提取带来了不利的影响。
三、发酵法甘油生产过程
1、原料 、 淀粉质、 淀粉质、糖质和纤维质 。 2、工艺路线 、 （1）厌氧亚硫酸盐法 ） 所用原料为淀粉质或糖蜜、 所用原料为淀粉质或糖蜜、亚硫酸钠及其 他营养盐。 他营养盐。培养基灭菌后冷却降温接入酿酒酵 母 ， 于 30～ 32℃ 控温发酵 ～ 3d， 发酵液即可 ～ ℃ 控温发酵2～ ， 进入提取阶段回收甘油。 进入提取阶段回收甘油。
例子： 例子：利用热冲击处理技术来提高甘油的产量
背景： 背景： （1）酵母在比常规发酵温度髙 ～20℃的温度下经 ）酵母在比常规发酵温度髙10～ 受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。 受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。 （2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压耐受 ） 发现热冲击能提高细胞对盐渗透压耐受 力 发现热冲击可使胞内3－ （3）Toshiro发现热冲击可使胞内 －磷酸甘油脱氢 ） 发现热冲击可使胞内 酶的活力提高15～ ％， ％，并导致甘油产量提高 酶的活力提高 ～25％，并导致甘油产量提高
实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的， 实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因 此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量 正交条件A 正交条件 冲击温度 （℃ ） 40，45，50 ， ， B 开始时机（h） 开始时机（ ） 8，16，30 ， ，
C 冲击时间（分） 15，30，60 冲击时间（ ， ， 结果发酵16小时， ℃冲击30分钟最佳 发酵96 分钟最佳， 结果发酵 小时，45℃冲击 分钟最佳，发酵 小时 小时后甘油浓度提高32.6％， ％， 小时后甘油浓度提高
第二节
甘油发酵工艺
厌氧条件下， 厌氧条件下 ， 酵母大量的将葡萄糖转 变成乙醇，而产物中只有很少的甘油， 变成乙醇，而产物中只有很少的甘油，在 酵母菌的其他厌氧发酵产品中（白酒、 酵母菌的其他厌氧发酵产品中（白酒、葡 萄酒、黄酒等） 甘油的含量也很少。 萄酒、黄酒等），甘油的含量也很少。
酒精发酵（酵母的第Ⅰ型发酵） 酒精发酵（酵母的第Ⅰ型发酵） alcoholic fermation
甘油合成机制
酵母在一定条件下培养， 酵母在一定条件下培养，可以利用糖分生成甘油 加入亚硫酸氢钠， 加入亚硫酸氢钠 ， 与乙醛 起加成作用 生成难溶的乙 醛亚硫酸氢钠加成物
酵母的第二型发酵
厌氧甘油发酵缺点
菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生； 菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生； 转化率较低，按照上述能量平衡计算， 转化率较低，按照上述能量平衡计算，糖与 甘油的转化率不可能超过50%，加上酵母增殖需 甘油的转化率不可能超过50% 50 要消耗一部分糖，发酵液中残留一部分糖， 要消耗一部分糖 ， 发酵液中残留一部分糖 ， 实 际转化率远低于50% 际转化率远低于50%，导致了厌氧发酵生产甘油 50 的成本较高。 的成本较高。