地中海贫血的遗传筛查和产前诊断

19.66 15.73 15.12 8.39
5
唇裂 / 腭裂
109
8.24
重型地贫:胎儿水肿综合征 早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症 无理想治疗方法
地贫纯合子：致死性出生缺陷
重型地贫
出生后1年内发病
多于未成年前因严重贫血而夭折
输血和去铁治疗可维持,代价昂贵
研究背景
和 地中海贫血的遗传筛查和产前诊断
Genetic Screening and Prenatal Diagnosis for and thalassemia in Guangdong
Meizhou 2006, December 07
徐湘民 南方医科大学，医学遗传学教研室 南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心 Southern Medical University
Diagnosis
Patient 1 Bart’s hydrops fetalis Patient 2 Hb H disease Patient 3 thal trait
胎儿脐带血血红蛋白电泳图谱
本实验室应用的主要技术
技术名称
Gap-PCR RDB 半变性DHPLC* SBE/FP* PE/DHPLC -链ELISA assay
多重引物延伸DHPLC（multiplex PE / DHPLC）
用于 α和 β地贫产前诊断的方法 (1993-2003 )
年份
1993 – 2003 1999 – 2003
主要诊断技术
胎儿血分析 超声诊断 (DNA: Gap-PCR) DNA: ASO 杂交 DNA: 反向点杂交 PE / DHPLC
5’ UTR
1
IVS1
2
IVS2
3
3’ UTR
A
B
C
Fragment size: A = 453 bp
B = 364 bp C = 423 bp
One set of PCR conditions
DHPLC的三种 操作模式
非变性分析（ 50 C ）
双链DNA大小测定
半变性分析（ 52-78 C ）
α地贫 (%) β地贫 (%)
检
测 出 的 阳 性 夫 妇 数
β地贫 (%) α/β 地贫(%)
完 成 的 产 前 诊 断 数
α地贫 (%) β地贫 (%)
α地贫 (%)
1993
1994
3989
4564
68393
71617
350
421
232 (5.8)
265 (5.8)
129 13 8 (3.2) (3.7) (2.3)
361
464 401 425 465
227 (5.8)
285 (5.7) 250 (5.7) 263 (5.8) 285 (5.7)
142 17 7 (3.6) (4.7) (1.9)
181 19 8 (3.6) (4.1) (1.7) 158 21 7 (3.6) (5.2) (1.7) 172 17 8 (3.8) (4.0) (1.9) 186 24 8 (3.7) (5.2) (1.7)
198对 83对
产前诊断：187 例 地贫 82例 β地贫
54例Bart’s水肿儿和Hb H病
18例重型β地贫
1
2
3
4
地贫携带者 系列1
筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇 地贫1 β地贫 地贫 β地贫 5.7% 3.6% 4.4% 1.8%
广州市妇婴医院 1993-2003 筛查计划的结果
产前诊断结果
采用Gap-PCR进行--SEAα地贫基因缺失的基因分型
--SEAα地贫缺失的基因分型结果
Family 1
Family 2
Family3
M
N
P
B
Fa Mo Fe Fa Mo Fe Fa Mo Fe
Normal Mutant
Normal
Heterozygote Homozygote
三个α地贫家庭的产前诊断结果
46 21 15 14 13 12 10 8 3 2 3 1 2 1 1 0 49 23 18 15 15 13 11 8
频率 ‰
0.91 0.43 0.34 0.28 0.28 0.24 0.20 0.15
Total
139
13
152
2.83
广州市妇婴医院 1993-2003 筛查计划的结果
年份 筛查 孕妇数 广州总 筛查 孕妇数 丈夫数 筛查发现的 阳性孕妇数
164 18 8 (3.6) (4.3) (1.9)
10 (2.9)
9 (2.1)
12 7 (92.3) (87.5)
16 8 (88.9) (100)
1995
1996 1997 1998 1999
3902
4994 4392 4532 5016
71751
74460 71989 75378 80141
CD2/CD14-15
CD17/N CD2/CD27-28 -28/CD27-28/CD2/-98 CD26/N CD27-28/N -73/N
-73/N
DHPLC 检测β地贫突变的结果
Thalassemia
研究背景
中国南方不同高发地 区人群携带率 1 ~ 23%
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
中国南方α和β地贫的人群携带率
地区
广东 携带率(%) 地贫 β地贫
8.53 14.95 1.92 — 2.54 6.78 2.18 4.72
广西
四川 贵州
台湾 香港
4.20 5.02
产 前 诊 断 例 数
α地贫 126 61 β地贫 – –
总数
PNDs 126 61
1993.1–1993.12
– – –
7 70 6
7 70 6
1994 – 2002 2003.1–2003.12
Bart’s A F A2 origin
Patient2 Patient1 Patient3 Fetal Adult
突变鉴定
全变性分析（ 78-80 C ）
Oligo和RNA分析
PCR产物的半变性分析（ 52-78 C ）
Reference Samples
Wild type Mutant Heteroduplexes Homoduplexes
PCR Products
Fragment A
CD2/N -29/N -28/N
地中海贫血的产前诊断
胎儿取样技术
DNA诊断技术
-地贫的诊断
-地贫的诊断
羊膜穿刺 (amniocentesis) 抽取胎儿样品示意图
DNA诊断技术
多重PCR （multiplex PCR）
等位基因特异性性寡核苷酸杂交（ASO）
反向点杂交 （RDB）
变性高效液相色谱（DHPLC）
与美国商品化UBI试剂盒的对比研究
Transcription
Frameshift
RNA splicing
Nonsense codon
Initiator codon
Double heterozygote
EXON 1
IVS 1
EXON 2
IVS 2
EXON 3
中国南方β地贫突变的变异类型和位置
DHPLC 分析人β珠蛋白基因: 三个PCR片段扩增
α地贫 (%) β地贫 (%)
检 测 出 的 阳 性 夫 妇 数
α地贫 (%) β地贫 (%) α/β 地贫(%)
完 成 的 产 前 诊 断 数
α地贫 (%) β地贫 (%)
2000 2001 2002 2003 Total
4492 4521 4695 4124
81817 80152 80667 86393
研究地中海贫血的意义
重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题
通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病
预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求
应用于地贫 控制的人群筛查策略


基于医院水平的预防计划
基于社区水平的预防计划 扩展的家系筛查计划
Allele 数
478
232 174
%
8.53
4.14 3.10
(-α4.2) Deletion
(-αCS) Mutation (--THAI) Deletion (-αQS) Mutation (--11.1) Deletion 2CD118(+TCA) --gene deletion
53
10 2 2 1 1 1
7 (100) 8 (100) 8 (100) 6 (100)
49221 860758
2804 1783 198 83 131 187 82 (5.7) (3.6) (4.4) (1.8) (2.9) (95.8) (98.8)
2804
Total of 4503 couples screened
1783
Allele 数
198
72 48 33 10 8 7 7 4 4 1
%
2.54
0.92 0.62 0.42 0.13 0.09 0.09 0.09 0.05 0.05 0.01
Undetermined
3
0.06
广东省年高风险妊娠预测数据（95%CI）
重型或中间型β地贫：
645 （480，835）
Bart’s胎儿水肿综合征：1714 （1498，1945）
血红蛋白（Hb）H 病：
1677 （1467，1901）
广州市主要出生缺陷的发生率 (1998-2001)
排序 出生缺陷分析 例数
发生频率 (/10,0 00)
1 2 3 4
先天性心脏病 重型地贫 多指 肢体短缩
260 208 200 111
1.10 3.41
北
韶关
中
广州 汕头
东
西
湛江
珠海
南 广东省五个地区地中海贫血 遗传流行病学调查
Journal of Clinical Pathology, 2004; 57(5):517-22.
广东省人群中地贫的携带者频率
遗传变异
地贫染色体
(--SEA) Deletion (-α3.7) Deletion
12 (3.3)
12 (2.6) 10 (2.5) 12 (2.8) 14 (3.0)
15 7 (88.2) (100)
17 8 (89.5) (100) 18 7 (85.7) (100) 17 (100) 8 (100)
23 8 (95.8) (100)
( cont’d )
年份 筛查 孕妇数 广州总 筛查 孕妇数 丈夫数 筛查发现的 阳性孕妇数
418 411 415 372 4503
256 172 21 7 16 21 (5.7) (3.8) (5.0) (1.7) (3.8) (100) 254 164 17 8 12 17 (5.6) (3.6) (4.1) (1.9) (2.9) (100) 260 163 16 8 11 16 (5.6) (3.4) (3.9) (1.9) (2.7) (100) 227 152 15 6 13 15 (5.5) (3.6) (4.0) (1.6) (3.5) (100)
0.95
0.18 0.04 0.04 0.02 0.02 0.02
Undetermined
2
0.04
广东省人群中β地贫的携带者频率
遗传变异
β地贫染色体
Deletion of CTTT at codons 41-42 C→T at position 654 in IVS2 A→G at nucleotide -28 G→A at codon 26 A→T at codon 17 Insertion of A at codons 71-72 G→T at codon 43 A→G at nucleotide -29 Insertion of A at codons 27-28 -gene deletion
中国南方地贫人群预防的首个前瞻性筛查计划

时间：1993.01.01 ~ 2003.12.31

基于医院的预防计划: 广州市妇婴医院 占广州市出生数的 1 / 17 策略：孕期杂合子筛查
结合现行的孕期健康产科检查实施


被检对象（婚前或孕中期） 血液学分析（MCV，Hb A2变化）
排除地贫
遗传咨询 双亲基因分析
应用对象
α地贫常见突变 α地贫／β地贫 α地贫／β地贫 β地贫常见突变 β地贫5种常见突变 α地贫SEA缺失突变
-50kb
-10kb
0kb
10kb
20kb
30kb
2 1
(--SEA) Deletion (- 4.2) Deletion (- 3.7) Deletion
导致α地贫的不同类型的基因缺失
地贫携带者 遗传咨询，配偶检查 血液学分析（MCV Hb A2变化） 地贫携带者 排除地贫
胎儿产前诊断
地贫携带者筛查及产前诊断流程
筛查结果
异常血红蛋白筛查结果
异常血红蛋白
Hb E Hb H Hb CS Hb G* Hb Q* Hb N* Hb D* HB New York
阳 性 病 例 数 孕妇 配偶 总数