扩增基因全长实验技术.

试剂盒 选取
Clontech公司
全称：
SMART RACE cDNA amplification kit 优点： 操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高
缺点： 不知道能否拿到完整的5’UTR. 价钱：中等偏上。
5’RACE
5’
polyA 3’
原理
Oligo(dT)primer
cDNA
第 一 条 链 合 成 机 制
扩 增 基 因 全 长 实 验 技 术
目录
以介绍5’RACE技术为主
1 2 获取基因全长简介 基因初步验证 基因全长获取（RACE技术） RACE产物鉴定 对序列进行生物信息学分析
3
4 5
获取基因全长简介 为什么要获取基因全长？
来自百度文库
获取全长cDNA是研究 基因功能的关键，是 进行基因功能及产物 分析的必要前提。
（2）制备B管：冰上操作。 1.0-2.75ul RNA 1.0ul 5'-CDS Primer A 再加入无菌水，使体积达到3.75ul。 混合溶液，并用掌上离心机离心。72℃ 3分钟，42℃ 2分钟。 此过程可在PCR仪中进行。之后14000g离心10s。如果是做 5’RACE，则加入1ul SMARTer IIA oligo。 此时B管体积为4.75ul。
5’
polyA 3’
polyA 3’
polyA 3’ 3’ 5’
5’RACE
LUP
3’
polyA 3’ 5’
原理
Suppression PCR:阻抑聚合酶反应
5’ 3’ 3’ GSP1
5’
SUP
5’ 3’
3’ GSP1 5’
5’ 3’
3’ 5’
实验 过程
合成cDNA第一条链
（1）制备A管：加好后放在室温下。共计4ul。 2.0ul 5X First-Strand Buffer 1.0ul DTT(20 mM) 1.0ul dNTP Mix(10 mM) 4.0ul Total Volume
实验 过程
合成cDNA第一条链
（3）在上一步放入PCR仪中后，在之前放在室温下的A管 中加入：（室温进行） 0.25ul RNase Inhibitor(40 U/μl) 1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase(100 U)
加上之前A管中的4ul，此时总体积为5.25ul。 （4）将A管中的混合液体5.25ul加入到B管4.75ul中。使体积 达到10ul。缓慢吸打混合，离心至管底部。之后将管放在 PCR仪中42℃90分钟。70℃10分钟。 （5）在管中加入Tricine-EDTA Buffer 100ul。（在总RNA的 浓度≥200ng时） -20℃保存3个月。
对Southern杂 交结果进行分析 4种方法
凝胶回收
对PCR产物进行凝胶回 收，确认片段大小，对 回收产物进行测序。
克隆测序
对RACE产物进行克 隆测序，建议选取810个克隆进行测序。
谢 谢
EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标 签—是从一个随机选择的 什么是EST？ cDNA 克隆，进行5’端和3’ 端单一次测序挑选出来获得 的短的cDNA 部分序列,代表 获取基因全长基本流程？ 一个完整基因的一小部分,在 数据库中其长度一般从20 到 7000bp 不等,平均长度为 360 ±120bp 。
PCR反应体系： 5’RACE ready cDNA : 2.5ul UPM（10*）：5ul GSP1（10uM）：1ul Master Mix：41.5ul Total：50ul
RACE产物的鉴定
产物位置、大小 比较GSPs和NGSPs 作为引物时扩增得到 的产物。
Southern Blot
获取基因全长基本流程
以本实验室具体情况为例子
构建数据库
库
筛选EST序列
普通PCR进行初步验证 RACE技术
筛选EST 基因初步验证
获取基因全长
进行全序列分析
生物信息学分析
基因初步验证
1. Blast比对 2. ORF比对 3. 相似序列 多重比对 4. 家族成员 多重比对 •设计引物 •提取RNA •反转录 •PCR扩增
凝胶回收
测序
PCR扩增
生物信息学分析
Ⅰ电泳检测 Ⅱ凝胶回收 Ⅲ电泳检测 Ⅳ克隆
PCR产物测序 凝胶回收测序 克隆后菌液测序 克隆后质粒测序
基因全长获取
RACE 简介 试剂盒 选取
5’RACE
原理 实验 过程
方法
RACE技术
RACE 简介
cDNA末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends, RACE) 技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序 列来获得完整cDNA序列的一种方法。 分为3’RACE 和5’RACE
实验 过程
RACE PCR
每50ul的体系中先合成41.5ul的Master Mix: 34.5ul 5.0ul 1.0ul 1.0ul PCR-Grade Water HiFi PCR Buffer dNTP HiFi Mix
实验 过程
RACE PCR
PCR反应程序： 94℃ 3min 30cycles 94°C 30 sec 68°C 30 sec 72°C 3 min 72℃ 10min 4℃ +∞