中性粒细胞碱性磷酸酶

中性粒细胞碱性磷酸酶

（N-ALP NAP）

碱性磷酸酶包括一组在PH中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。一．正常分布：

人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性，主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中，其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞，血小板，浆细胞等均为阴性反应，网状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。

二．生理变化：

1．年龄变化：新生儿ALP极高，随后下降，成人较儿童期减低，老年期（>6）最低。2．性别差异：无差别，但也有报道女>男。

3．季节变化：夏季为高。

4．应激状态下的变化：紧张、恐惧、休克、激烈运动等。

5．妊娠期的变化：妊娠2~3个月时。NAP轻度高。以后逐月趋于显著。

6．与激素的关系：肾上腺皮质激素，雌激素和ACTH都有使NAP活性升高，有人认为ACTH的作用是通过肾上腺皮质而发生的。

三．临床意义：

1．重度增高：

类白血病反应：NAP活性极度增高与CML鉴别。

感染：细菌感染的NAP改变比较明显，其中，NAP活性高度增高者见于各种急性化脓性感染（如败血症、大叶性肺炎、化脓性脑膜炎等）。

2．中度增高：

感染：见于支气管肺炎、肾盂肾炎。

贫血：AA。

非AL性骨髓增生性疾患：PV、骨髓纤维化、CML合并骨髓硬化症、持发性ITP、AL：ALL。

恶性淋巴瘤：何杰金氏淋巴瘤。

3．轻度增高：

感染：上呼吸道感染、肺结核等。网状细胞增高，遗传性低NAP症。

AL：MM、神经母细胞瘤。

贫血：溶血性贫血。

4．降低：

贫血：镰形细胞贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿。

AL：CML显著减低

感染：病毒性感染、特别是病毒性肺炎。

5．正常或无规律：急粒的NAP活性可减低也可正常。并发感染时可有中度升高。当治疗后充分缓解时，有些NAP活性可恢复正常。单核细胞改变缺乏的规律性，绿色瘤和M6与急粒相似。

网状细胞肉瘤多数病例增高，少数在正常范围内。

淋巴肉瘤可增高，可正常。MDS可增高、正常和减低。

主要鉴别：

1．CML—类白2．PNH—AA 3．ALL—ANLL

4．PV—反应性PV 5．细菌升高—病毒（特别是肺炎）

四．染色方法：

碱性磷酸酶是一种能分解磷酸酯的水解酶，方法不同，原理不同。国际标准化委员会提

出。推荐的方法应该是快速，简便，容易重复，并有很宽的技术范围。

方法：（1）钙—钴法

（2）未取代萘酚法：底物а—磷酸萘酚钠。

（3）取代萘酚法：国际标准委员会推荐两种方法:

A．1963年Kaplow 等：萘AS-BI磷酸盐

B．1963年Tomonaga等：萘AS-MX磷酸盐

国际标准化委员会认为а—萘磷酸盐产生的反应产物。生色团不好，并且是水溶性的，因此使用这种基质的方法是不满意的，只有考虑应用那些萘磷酸的代用品。适当耦联物的选择是基于从技术观点看耦联物的特性，及它们是否容易获得，这两个方面。萘AS-BI磷酸盐，结果快。萘AS-MX磷酸盐，因为它耗费时间，除日本外其它国家很少了解，但它对白细胞中酶染色的质量是比较好的。其它细胞化学反应的技术因素，如固定pH范围，温浴时间，温浴介质的缓冲作用等也应予以考虑。国外大都应用萘酚AS-BI磷酸。

上海儿研所对三种白细胞碱性磷酸酶染色方法的评价，认为（1）钙钴法平均阳性指数最低仅2.12。虽有人主张延长孵育时间以提高阳性率和阳性指数，但由于孵育时间长，易使阳性产物扩散；且钙—钴法的基质液的配制较麻烦，影响其结果的因素很多。（2）未取代萘酚法虽然反应时间缩短，阳性指数正常值相对较为稳定，但基质液不能长期保存，每次需临时配制孵育液。（3）取代萘酚法较其它方法有以下特点，酶活性显示较充分，正常值68%以上可以显示LAP活性，阳性指数均值较其它方法高，反应酶的钝化与丢失较少，阳性产物色泽鲜明，溶解度低，不扩散，因而定位精确，有利于评定ALP活性强度的分级，例三者平均值。

表一 NAP三种试验方法比较

染色方法介绍：

一钙-钴法：

（一）原理：磷酸酶能水解各种磷酸有机盐，并释放出磷酸，组化方法是利用被释放出来磷酸与Ca2+结合，成为磷酸钙而沉淀下来，再与硝酸钴与硫化铵作用。生成黑色的

硫化钴。

（二）试剂

1．孵育液：3% β-甘油磷酸钠 10ml 2% 巴比妥钠 30ml

2% Ca(NO3)2 20ml 2% mgsO4 2ml

混匀，以0.5NaoH调pH至9.3-9.4置5’后即可。

2．2%巴比妥钠

3．1%硫化铵

4．0.5%伊红

5．0.5%美兰

（三）步骤：

DW1g DW冲干干冲

B 95%乙醇孵育液 2%硝酸钴 1%硫化铵5’ 0.5%伊红 0.5%美兰镜检

固定10’ 37℃6h 干 5’干冲冲干

（四）正常值：阳性率阳性指数

B 53.7% 81.9±6.4

BM 49.2% 84.7±9.8

此方法阳性率低，时间长，稳定性差，影响因素多，现基本不在采用。

二偶氮染料法：萘AS-MX磷酸盐

（一）原理：底物在pH 9.5被WBC中酶水解产生磷酸和芳基萘胺，芳香萘胺再与偶氮偶联，形成不溶性染料。

（二）试剂：

萘酚AS-MX磷酸钠盐（sigma）

固兰RR 冰醋酸α-氨基-2-甲基1,3丙二醇 N,N-二甲基甲酰胺

甲醛甲醇藏红花红O

a．固定剂：取10ml甲醛和0.01ml冰醋酸，加入到90ml甲醇中充分混匀，保存在冰箱、冰盒中备用。

b．贮存缓冲液（0.2M PH 8.6丙二醇）

取2.1gα-氨基-2-甲基1,3丙二醇溶于4ml N,N-二甲基甲酰胺中，再向此溶液中，加入76ml贮存缓冲液和120ml DW，混匀放4℃冰箱，备用。

C．作用液：贮存底物溶液 20ml 固兰RR 20mg 充分混匀，用前迅速过滤。

d．复染液：0.5% 藏红花红O。

（三）步骤：

水冲水冲

B 固定剂作用液复染液

5’’干 2h 干

（四）结果：酶活性呈现为不连续的分散的兰色颗粒，在人中性粒细胞胞浆中，细胞浆染成浅红色，很少的淋巴细胞可呈现很弱的反应，其它细胞无反应。

（五）分级标准：

（-）无燃料颗粒。

（+）5个燃料颗粒以内。

（++）5个以上到30个可以清楚计数的颗粒。

（+++）30个以上呈不同均匀分布的颗粒。

（++++）30个颗粒以上分布不均匀，颗粒之间可以清楚辨别。

（+++++）中性粒细胞胞浆内充满于颗粒，且颗粒之间不可清楚辨别。

（六）正常值：阳性率>68% 阳性指数164-380

上海儿研所80年进行观察：

（一）不同重氮盐的显示效果。从分解速度，产物色泽和无解来说以坚牢兰RR所得结果最好。