红曲米酒发酵技术

一、实验项目名称：红曲米酒发酵技术

二、实验目的和要求：

本项目以红曲霉为发酵菌种，通过学习红曲霉的生物学特性，红曲霉菌种扩大培养，固态发酵工艺及液态深层发酵工艺，了解和理解红曲米酒生产方法。

具体项目包括：

1.红曲霉斜面制作及生物学形态观察；

2.红曲霉及酵母菌菌种扩大培养；

3. 红曲固态发酵实验；

4、酒精发酵及酒精测定；

5、红曲米酒风味综合测评。

三、实验器材：

1、溶液和试剂：

酵母膏、葡萄糖、琼脂粉、水、CaCO3、麦芽汁琼脂培养基。

2、仪器和其他用品：

接种环、烧杯、试管、量筒、药匙、纱布、pH试纸、牛皮纸（或报纸）、玻璃棒、酒精灯、锥形瓶、三口烧瓶、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、记号笔、冷凝管、离心机、霉菌培养箱等。

3、实验材料：

红曲霉菌、酵母菌。

一些实验装置示意图：

蒸馏装置酒精计

高压蒸汽灭菌锅过滤装置

离心机

四、实验原理：

红曲米酒发酵的过程中需要两种菌的参与，分别为红曲霉菌、酵母菌。红曲霉菌是一种红色霉菌，属于好氧性真菌，培养和发酵的过程中需要氧气德参与。而酵母菌的酒精发酵则是在厌氧发酵的条件下发生的，应该严格控制不要让氧气进入发酵体系，因此本次红曲米酒发酵可以在霉菌培养箱中进行。

培养这些菌需要不同的培养基，因此需要对培养基进行配制。制作的培养基是为了扩大培养所需要的两种菌所准备的，培养这些菌需配制适宜的培养基，曲霉菌和酵母菌都可以采用琼脂培养基。

整个培养过程中要注意防止杂菌侵入以免实验失败。接种操作要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯的火焰上方和周围一定区域为无菌区，在此范围内操作可以确保无菌，可以避免杂菌污染实验材料。高温对微生物具有致死作用，接种时要用火焰直接灼烧接种环，以达到灭菌目的，但一定要保证其冷却后方可进行转接，以免烫死用作菌种的微生物。

对实验材料要进行灭菌，消毒灭菌有很多方法，如：干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法、紫外线照射法和微孔滤膜法等。本实验要灭菌，灭菌采用高压蒸汽灭菌法，灭菌在121℃下灭菌20min，在高压蒸汽灭菌锅开始灭菌之前要进行对锅内的冷空气进行排空。应用高压蒸汽灭菌锅要等水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，因蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。同一温度下，湿热的灭菌效力比干热大，因为：一、湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二、湿热的穿透力比干热大，三、湿热的蒸汽有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

红曲米酒的发酵可分为三步：一、糖化；二、酒精发酵。发酵出来的酒的好坏就取决于这两步，用红曲霉菌进行糖化影响到最终的发酵出来的酒的颜色和某些香味和口味，而酵母菌发酵影响到发酵完成后的酒精含量以及最终成品的品质。在发酵好之后可通过测定酒精含量来确定发酵的最终结果，测定用酒精计进行。

为得到酒的成品还要对最终发酵产物进行过滤和离心等。

五、实验内容和操作步骤：

培养基的制备可以按照培养基的配方来进行：

其中麦芽汁琼脂培养基的制作过程有：

（1）将干麦芽磨碎，按一份麦芽四份水，65℃水浴锅糖化3~4h（糖化程度用碘滴定）

（2）糖化液4~6层纱布过滤，滤液如果混浊，用鸡蛋白澄清（将一个鸡蛋白加水约20ml，调匀至生泡沫为止，然后倒糖化液中搅拌煮沸后过滤。

（3）将滤液稀释到5~6波美度，pH约6.4，加入2%琼脂，然后放121℃灭菌20min 即可。

酵母膏琼脂培养基的配方：

酵母膏1%，葡萄糖0.3%，CaCO3 1%，琼脂1.5%，并且调pH到7.0~7.2

按此配方依次溶解，溶解后的培养基液体置于锥形瓶内加热到沸腾，加上纱布包好牛皮纸后放高压蒸汽灭菌锅在121℃灭菌20min

在制备好培养基后，可按实验要求，将培养基分装入试管内，分装高度以试管的1/4左右为宜，装好后加上棉塞并包上报纸放于高压蒸汽灭菌锅内，按要求操作，在121℃灭菌20min。将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右（以防止斜面上冷凝水太多），将试管口端面搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半的为宜。在试管斜面上接种在火焰旁进行，用接种环采用划之字型线来接种。接上菌种后放于适宜条件下培养3~5天左右。

实验过程分二步：

1. 糖化过程：将买来的饭称量约180g加入锥形瓶中，在瓶口加纱布并包上牛皮纸，

然后置于121℃灭菌20min，再在灭菌好的饭里接入已经培养好的红曲霉菌，放在30℃的恒温有氧培养条件下发酵约7天。实验过程中观察到现象如下：

接种后第三天接种后第五天接种后第七天

经过不断搅拌后的发酵物看起来一次比一次稀，并最后成稀糊状。通过观察也可以看到随时间推移，锥形瓶内的米饭颜色一天比一天红，发酵过程有特殊的香味产生。

2. 酒精发酵：在第一步的基础上开始，将已经糖化好的锥形瓶里接种酵母菌，同样

放在30℃的恒温但无氧培养条件下进行酒精发酵约7天。

期间观察现象有：接种后第二天，锥形瓶内液体上部分开始澄清，上层呈浅的黄色，底下的固体沉淀中出现气泡，国体呈浅红色。第三天，锥形瓶内液体上部分比第二天更澄清，且底下气泡明显增多。到7天时间结束时，气泡基本消失。此时发酵的产物有浓郁的香味和一些酒味。

3.发酵结束处理：待发酵完成后，采用过滤后再离心的方法来获得比较纯的酒制品

注：在发酵完成后要进行酒精度的测定，把第二步酒精发酵结束的锥形瓶取出一个，并把其中液体倒入一个三口烧瓶中并进行蒸馏，用一个量筒接蒸馏出来的液体。然后用标度为10以下的酒精计测量其中的酒精含量。

六、实验结果：

培养在斜面麦芽汁琼脂培养基上的红曲霉菌呈红色，菌落表面干燥，呈致密状，并伴有一种特殊的香味，在培养红曲霉菌的斜面麦芽汁琼脂培养基也被红曲霉分泌的色素染成红色。红曲霉有霉菌的明显特征，质地疏松，外观干燥，不透明，菌落与培养基的连接紧密，不容易挑取。

实验过程中总体上来说较好，但也存在问题。首先是在第一步的糖化过程，在接种的第三天就可以看到锥形瓶内发酵物有明显变红现象，但用玻璃棒搅拌后，接种菌后的米饭就会变稀。同时，随时间过去锥形瓶内米饭也越来越红，到糖化发酵结束时达到最红并有特殊香味。（可以注意到不经搅拌的米饭也随时间变红，锥形瓶内的水分也随时间增加）

在进行酒精发酵时，有发酵物的锥形瓶内出现很多气泡，并且锥形瓶内的液体随时间推移逐渐澄清。到发酵结束时，发酵物已经有相当的香味和酒味。酒精发酵结束后用酒精计测得发酵产物的酒精度为6.2% 。

最后经过过滤和离心后的成品酒体积约为180ml，呈浅红色，颜色比较均一，没有多余的沉淀物，并有特殊香味，看起来比较诱人。从气味上来看，香味比较醇厚，和一般的酿造酒相比，该发酵酒有其独特颜色和香味。