河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定_严进
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为对基质广适性链格孢种 , 多生于植物的枯死部分或 衰弱组织上[ 1] ;A.yaliinficiens和 A.ventricosa是美国
学者 R.G.Roberts分别于 2003年和 2007年从中国 出口的鸭梨果实上分离并命名的两个新种[ 2 -3] 。 近几年 , 对 Alternaria的鉴定 , 除采用传统的形
孢 A.yaliinficiensR.G.Roberts[ 2] 和 A.ventricosaR. G.Roberts[ 3] 。其中 A.gaisen既能侵染梨叶片也能
侵染梨果实 , 并产生寄主专化性毒素 ——— AK毒素 , 是 真正的梨黑斑病病原[ 1] ;A.alternata和 A.tenuissima
பைடு நூலகம்
定 。 供试菌株在 PDA平板上培养 3 ～ 5 天后 , 从菌 落边缘取菌丝块并进一步切成极细的小块 , 移到 50 mL马铃薯 -葡萄糖培养液中 , 25 ±0.5 ℃条件下摇 床 150 r/min震荡培养 2天 , 经滤纸抽滤菌丝 , 无菌 水 冲洗 3次 后 , 用灭菌吸水纸 吸去多余的水 份 , 置 -20 ℃冰箱中保存备用 。 另从 GenBank上下载 22 个 Alternaria不同菌种的序列进行系统发育关系分 析 (表 1)。 1.3.2 总 DNA提取 :总 DNA提取采用 CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)法 [ 2] 。 1.3.3 PCR扩增 :PCR反应体系 :10 ×PCR缓冲液 5 μL、2.5 mmol/LdNTP1 μL、10 mmol/L引物 1 μL、 Taq酶 1 U、模板 DNA0.1 mg, 加双蒸馏水至 50 μL。 空白对照不加任何 DNA模板 。选用王洪凯等[ 5] 报 道的一对引物 ITS1和 ITS4扩增核糖体基因 ITS15.8SrDNA-ITS2区 , 正向引物 ITS1序列为 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;反向引物 ITS4序列为 5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。扩增程序 :94 ℃变 性 5 min;94 ℃ 30s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 30s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 min。 选用 Berbee等 [ 8] 报道的一对引物 gpd1和 gpd2扩增 gpd基因片段 , 正向引物 gpd1序 列为 5′-CAACGGCTTGGGTCGCATTG-3′;反 向引 物 gpd2 序 列 为 5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′。 扩 增程序 :96 ℃变性 2min;96 ℃ 1 min, 48 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30个循环 ;72 ℃延伸 10 min。 1.3.4 序列分析 :PCR产物由上海博亚生物技术有 限公司测 序 。 将测得 的序列与 GenBank下 载的部 分链格孢菌的基因序列 (表 1)一起 , 用 ClustalX1.8 软件进行比对 , 采用最大简约法 (MP)构建 系统发 育树 。在最大简约树 (树集 )搜索中 , 采用启发式方 法搜索最佳系统树 , 所有特征被认为是等权和无序 的 , 同时 , 在 分 析 前 排除 非 简 约 信 息位 点 。 Bootstrapping用于评价各节点的支持率 , 测试中重复 1 000次 。 1.3.5 寄主专化性毒素 (AK毒素 )基因检测 :根据 GenBank中发表的 AK毒素合成酶基因序列 (AccessionNo.AB015351 AlternariaalternatageneforAKT1, completecds), 合成了两条引物 AKT-1和 AKT-2, 对 产孢表型属 A.gaisen组的 5个菌株 (表 2)进行 PCR 检 测 。 引 物 序 列 AK1:5′-AGCAGGAACAGCCGTATC-3′, AK2:5′-ACAGGGGCAACTTGAAAC-3′。 反 应条件 :95℃ 5 min;95 ℃ 15s, 50℃ 45 s, 72℃ 45 s, 35个循环 ;72℃延伸 5min。
Abstract:ToidentifythespeciesofAlternaria, thepathogenthatcausesblackspotonYa-pearsduring storage, theisolatedAlternariafrom thesporulationpattern, conidiacharactersandmolecularbiology wereexamined.Withmorphologicalandmolecularbiologicalstudyon188 isolatedstrainsofAlternaria, threespeciesareidentified, namelyAlternariaalternata, A.tenuissima, andA.infectoria, accountingfor 41.0%, 54.8%, and1.6% ofthetotalstrainsrespectively.BasedonITSandgpddata, itisevidently distinguishedbetweenthelarge-sporedAlternariaspp.andbetweenthelarge-andthesmall-sporedAlternariaspp.;itisnotdistinguishedamongthesamall-sporedAlternariaspp. Keywords:Alternaria;morphology;ITS;gpd
第 36卷 第 1期 2009年 2 月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
Vol.36 No.1 Feb. 2009
河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
严 进1 施宗伟1＊ 宋 福 2 黄文胜 1 陈 岩1 赵文胜2
(1.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100029;2.河北出入境检验检疫局 , 石家庄 050071)
1期
严 进等 :河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
39
序号 Number
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
表 1 部分链格孢菌的 GenBank序列号 Table1 AlistofAlternariaspecieswithGenBankaccessionnumberusedinthestudy
分别挑取上述菌落的单个孢子 , 转入马铃薯胡 萝卜培养基 (PCA)、1/2 马铃薯胡萝卜培养基 (1 /2 PCA)、干草培养基 (HAY)和 V8 培养基上培养 , 在 22 ℃下 , 两支 40W灯管 (色温 4200K)8 h照射和 16 h黑暗交替进行培养 , 灯管距离培养物约 40 cm, 培 养物面向上 , 于 1周后观察 。
IdentificationofAlternariaisolatesfrom Ya-pearfruits inHebeiandShandongprovinces
YanJin1 ShiZongwei1＊ SongFu2 HuangWensheng1 ChenYan1 ZhaoWensheng2
(1.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine, Beijing 100029, China;2.HebeiExitandEntry InspectionandQuarantineBureau, Shijiazhuang 050071, HebeiProvince, China)
38
植 物 保 护 学 报
36卷
王洪凯等 [ 5] 用 5.8SrDNA及 ITS区序列分析了链格 孢的种级分类 ;孙霞等 [ 6] 用 RAPD方法分析了鸭梨 上的 Alternaria各种间的亲缘关系 ;薛峰等[ 7] 对 Ulocladium、Stemphylium和 Alternaria的典型 菌种进行 了分子系统发育分析 , 构建了 ITS和 gpd基因序列 分子系统发育树 。
态学鉴定外 , 不少学者尝试用分子生物学的方法 , 如
基金项目:国家质量监督检验检疫总局科研项目(2003IK068) 作者简介:严进, 男 , 1962年生, 研究员 , 研究方向为检疫性真菌病害, email:yanjin@caiq.org.cn ＊通讯作者 (Authorforcorrespondence), email:shizongwei@vip.sina.com, Tel:010 -82262289;收稿日期 :2008-08 -06
摘要 :为了查清造成鸭梨果实储藏期黑斑病的链格孢 Alternaria的种类 , 从其产孢表型 、分生孢子 特征和分子生物学等方面对分离的链格孢菌进行了研究 。 经对分离到的 188支 Alternaria菌株的 形态学鉴定 , 共确定了 3个种 , 即链格孢 Alternariaalternata、细极链格孢 A.tenuissima和侵染链格孢 A.infectoria, 比例分别为 41.0%、54.8%和 1.6%。分子生物学研究结果表明 , Alternaria大孢子种 彼此间及大孢子种与小孢子种之间可以根据 ITS和 gpd序列差异明确区分 ;而供试的多数小孢子 种在 ITS和 gpd序列上差异很小 , 无法区分 。 关键词 :链格孢 ;形态学 ;内部转录间隔区 ;三磷酸甘油醛脱氢酶
链格孢的培养特性和鉴定在上述 4种培养基上 进行 。 将上述培养物在实体解剖镜 50 ×下观察产 孢表型组 。根 据 Simmons等 [ 4] 和 Roberts[ 2] 的分组 方法对分离到的 Alternaria菌株进行分组 。 分组后 , 取特征典型的菌株在显微镜下测量分生孢子大小 , 包括长 、宽 、喙长 、横纵 (斜 )隔膜数 , 孢子颜色 , 孢子 表面有无突起等 。每菌株测量 30个孢子 , 根据形态 将菌株鉴定到种 。 1.3 分子生物学研究 1.3.1 菌体培养 :从每组产孢表型中分别选取 3 ～ 13个菌株 , 进行 5.8SrDNA及 ITS区序列分析和三 磷酸甘油醛脱氢酶 (gpd)基因片段 核苷酸序列测
由链格孢 Alternaria引起的梨果实上的黑斑病 是重要的储藏期病害 , 在果实表面造成近圆形或不 规则黑褐色病斑 , 中间凹陷 , 潮湿时病斑表面生黑色 霉层 , 影响水果的质量和商品价值 。 2004年我国鸭 梨曾因黑斑病而被停止出口美国和加拿大 。
目前 , 世界上已报道的从梨果实上分离到的链 格孢共有 9个组 , 已命名的有 9个种 [ 1 -4] 。在中国 已报道的有 5个种 , 分别是梨黑斑链格孢 A.gaisen K.Nagano、链 格孢 A.alternata(Fr.)Keissler、细极 链格孢 A.tenuissima(Fr.)Wiltshire、鸭梨侵染链格
作者于 2005年收集了河北和山东两省部分冷 库中储存的具 Alternaria侵染症状的鸭梨进行了病 原菌分离和鉴定 。
1 材料与方法
1.1 病菌分离 从河北和山东两省部分果园的冷库中收集到表
面有黑斑症状的鸭梨 100余个 , 用 70%酒精擦洗病 健交界处及果柄表面 , 去除表皮 , 取果肉腐烂部分平 铺在带三层湿滤纸的培养皿内 , 并取果柄靠近基部 的一段纵向剖开 , 在滤纸上均匀摆好 。 置于培养箱 中 , 光照和黑暗各 12 h交替 , 25 ℃下培养 3 ～ 5天 。 将出现链格孢菌的培养皿置于实体显微镜 50 ×下 观察 , 用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子 链上的孢子转接于马铃薯 -胡 萝卜培养基 (PCA) (马铃薯 20 g、胡萝卜 20 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1 000 mL)平板上 。 将平板置于上述光照和温度条件下培 养 5 ～ 7天。 1.2 形态鉴定
学者 R.G.Roberts分别于 2003年和 2007年从中国 出口的鸭梨果实上分离并命名的两个新种[ 2 -3] 。 近几年 , 对 Alternaria的鉴定 , 除采用传统的形
孢 A.yaliinficiensR.G.Roberts[ 2] 和 A.ventricosaR. G.Roberts[ 3] 。其中 A.gaisen既能侵染梨叶片也能
侵染梨果实 , 并产生寄主专化性毒素 ——— AK毒素 , 是 真正的梨黑斑病病原[ 1] ;A.alternata和 A.tenuissima
பைடு நூலகம்
定 。 供试菌株在 PDA平板上培养 3 ～ 5 天后 , 从菌 落边缘取菌丝块并进一步切成极细的小块 , 移到 50 mL马铃薯 -葡萄糖培养液中 , 25 ±0.5 ℃条件下摇 床 150 r/min震荡培养 2天 , 经滤纸抽滤菌丝 , 无菌 水 冲洗 3次 后 , 用灭菌吸水纸 吸去多余的水 份 , 置 -20 ℃冰箱中保存备用 。 另从 GenBank上下载 22 个 Alternaria不同菌种的序列进行系统发育关系分 析 (表 1)。 1.3.2 总 DNA提取 :总 DNA提取采用 CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)法 [ 2] 。 1.3.3 PCR扩增 :PCR反应体系 :10 ×PCR缓冲液 5 μL、2.5 mmol/LdNTP1 μL、10 mmol/L引物 1 μL、 Taq酶 1 U、模板 DNA0.1 mg, 加双蒸馏水至 50 μL。 空白对照不加任何 DNA模板 。选用王洪凯等[ 5] 报 道的一对引物 ITS1和 ITS4扩增核糖体基因 ITS15.8SrDNA-ITS2区 , 正向引物 ITS1序列为 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;反向引物 ITS4序列为 5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。扩增程序 :94 ℃变 性 5 min;94 ℃ 30s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 30s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 min。 选用 Berbee等 [ 8] 报道的一对引物 gpd1和 gpd2扩增 gpd基因片段 , 正向引物 gpd1序 列为 5′-CAACGGCTTGGGTCGCATTG-3′;反 向引 物 gpd2 序 列 为 5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′。 扩 增程序 :96 ℃变性 2min;96 ℃ 1 min, 48 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30个循环 ;72 ℃延伸 10 min。 1.3.4 序列分析 :PCR产物由上海博亚生物技术有 限公司测 序 。 将测得 的序列与 GenBank下 载的部 分链格孢菌的基因序列 (表 1)一起 , 用 ClustalX1.8 软件进行比对 , 采用最大简约法 (MP)构建 系统发 育树 。在最大简约树 (树集 )搜索中 , 采用启发式方 法搜索最佳系统树 , 所有特征被认为是等权和无序 的 , 同时 , 在 分 析 前 排除 非 简 约 信 息位 点 。 Bootstrapping用于评价各节点的支持率 , 测试中重复 1 000次 。 1.3.5 寄主专化性毒素 (AK毒素 )基因检测 :根据 GenBank中发表的 AK毒素合成酶基因序列 (AccessionNo.AB015351 AlternariaalternatageneforAKT1, completecds), 合成了两条引物 AKT-1和 AKT-2, 对 产孢表型属 A.gaisen组的 5个菌株 (表 2)进行 PCR 检 测 。 引 物 序 列 AK1:5′-AGCAGGAACAGCCGTATC-3′, AK2:5′-ACAGGGGCAACTTGAAAC-3′。 反 应条件 :95℃ 5 min;95 ℃ 15s, 50℃ 45 s, 72℃ 45 s, 35个循环 ;72℃延伸 5min。
Abstract:ToidentifythespeciesofAlternaria, thepathogenthatcausesblackspotonYa-pearsduring storage, theisolatedAlternariafrom thesporulationpattern, conidiacharactersandmolecularbiology wereexamined.Withmorphologicalandmolecularbiologicalstudyon188 isolatedstrainsofAlternaria, threespeciesareidentified, namelyAlternariaalternata, A.tenuissima, andA.infectoria, accountingfor 41.0%, 54.8%, and1.6% ofthetotalstrainsrespectively.BasedonITSandgpddata, itisevidently distinguishedbetweenthelarge-sporedAlternariaspp.andbetweenthelarge-andthesmall-sporedAlternariaspp.;itisnotdistinguishedamongthesamall-sporedAlternariaspp. Keywords:Alternaria;morphology;ITS;gpd
第 36卷 第 1期 2009年 2 月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
Vol.36 No.1 Feb. 2009
河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
严 进1 施宗伟1＊ 宋 福 2 黄文胜 1 陈 岩1 赵文胜2
(1.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100029;2.河北出入境检验检疫局 , 石家庄 050071)
1期
严 进等 :河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
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序号 Number
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
表 1 部分链格孢菌的 GenBank序列号 Table1 AlistofAlternariaspecieswithGenBankaccessionnumberusedinthestudy
分别挑取上述菌落的单个孢子 , 转入马铃薯胡 萝卜培养基 (PCA)、1/2 马铃薯胡萝卜培养基 (1 /2 PCA)、干草培养基 (HAY)和 V8 培养基上培养 , 在 22 ℃下 , 两支 40W灯管 (色温 4200K)8 h照射和 16 h黑暗交替进行培养 , 灯管距离培养物约 40 cm, 培 养物面向上 , 于 1周后观察 。
IdentificationofAlternariaisolatesfrom Ya-pearfruits inHebeiandShandongprovinces
YanJin1 ShiZongwei1＊ SongFu2 HuangWensheng1 ChenYan1 ZhaoWensheng2
(1.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine, Beijing 100029, China;2.HebeiExitandEntry InspectionandQuarantineBureau, Shijiazhuang 050071, HebeiProvince, China)
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植 物 保 护 学 报
36卷
王洪凯等 [ 5] 用 5.8SrDNA及 ITS区序列分析了链格 孢的种级分类 ;孙霞等 [ 6] 用 RAPD方法分析了鸭梨 上的 Alternaria各种间的亲缘关系 ;薛峰等[ 7] 对 Ulocladium、Stemphylium和 Alternaria的典型 菌种进行 了分子系统发育分析 , 构建了 ITS和 gpd基因序列 分子系统发育树 。
态学鉴定外 , 不少学者尝试用分子生物学的方法 , 如
基金项目:国家质量监督检验检疫总局科研项目(2003IK068) 作者简介:严进, 男 , 1962年生, 研究员 , 研究方向为检疫性真菌病害, email:yanjin@caiq.org.cn ＊通讯作者 (Authorforcorrespondence), email:shizongwei@vip.sina.com, Tel:010 -82262289;收稿日期 :2008-08 -06
摘要 :为了查清造成鸭梨果实储藏期黑斑病的链格孢 Alternaria的种类 , 从其产孢表型 、分生孢子 特征和分子生物学等方面对分离的链格孢菌进行了研究 。 经对分离到的 188支 Alternaria菌株的 形态学鉴定 , 共确定了 3个种 , 即链格孢 Alternariaalternata、细极链格孢 A.tenuissima和侵染链格孢 A.infectoria, 比例分别为 41.0%、54.8%和 1.6%。分子生物学研究结果表明 , Alternaria大孢子种 彼此间及大孢子种与小孢子种之间可以根据 ITS和 gpd序列差异明确区分 ;而供试的多数小孢子 种在 ITS和 gpd序列上差异很小 , 无法区分 。 关键词 :链格孢 ;形态学 ;内部转录间隔区 ;三磷酸甘油醛脱氢酶
链格孢的培养特性和鉴定在上述 4种培养基上 进行 。 将上述培养物在实体解剖镜 50 ×下观察产 孢表型组 。根 据 Simmons等 [ 4] 和 Roberts[ 2] 的分组 方法对分离到的 Alternaria菌株进行分组 。 分组后 , 取特征典型的菌株在显微镜下测量分生孢子大小 , 包括长 、宽 、喙长 、横纵 (斜 )隔膜数 , 孢子颜色 , 孢子 表面有无突起等 。每菌株测量 30个孢子 , 根据形态 将菌株鉴定到种 。 1.3 分子生物学研究 1.3.1 菌体培养 :从每组产孢表型中分别选取 3 ～ 13个菌株 , 进行 5.8SrDNA及 ITS区序列分析和三 磷酸甘油醛脱氢酶 (gpd)基因片段 核苷酸序列测
由链格孢 Alternaria引起的梨果实上的黑斑病 是重要的储藏期病害 , 在果实表面造成近圆形或不 规则黑褐色病斑 , 中间凹陷 , 潮湿时病斑表面生黑色 霉层 , 影响水果的质量和商品价值 。 2004年我国鸭 梨曾因黑斑病而被停止出口美国和加拿大 。
目前 , 世界上已报道的从梨果实上分离到的链 格孢共有 9个组 , 已命名的有 9个种 [ 1 -4] 。在中国 已报道的有 5个种 , 分别是梨黑斑链格孢 A.gaisen K.Nagano、链 格孢 A.alternata(Fr.)Keissler、细极 链格孢 A.tenuissima(Fr.)Wiltshire、鸭梨侵染链格
作者于 2005年收集了河北和山东两省部分冷 库中储存的具 Alternaria侵染症状的鸭梨进行了病 原菌分离和鉴定 。
1 材料与方法
1.1 病菌分离 从河北和山东两省部分果园的冷库中收集到表
面有黑斑症状的鸭梨 100余个 , 用 70%酒精擦洗病 健交界处及果柄表面 , 去除表皮 , 取果肉腐烂部分平 铺在带三层湿滤纸的培养皿内 , 并取果柄靠近基部 的一段纵向剖开 , 在滤纸上均匀摆好 。 置于培养箱 中 , 光照和黑暗各 12 h交替 , 25 ℃下培养 3 ～ 5天 。 将出现链格孢菌的培养皿置于实体显微镜 50 ×下 观察 , 用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子 链上的孢子转接于马铃薯 -胡 萝卜培养基 (PCA) (马铃薯 20 g、胡萝卜 20 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1 000 mL)平板上 。 将平板置于上述光照和温度条件下培 养 5 ～ 7天。 1.2 形态鉴定