大鼠骨髓内皮祖细胞 SPIO
2011年3月第8卷第9期·短篇论著·
EPCS是一类能分化成为血管内皮细胞的干细胞。1997年Asahara等[1]报道EPCS分离成功，并在体内证明其血管生成的能力。随后的研究显示这些细胞来源于骨髓，可特异性地向血管形成的部位（包括缺血组织及肿瘤微环境）归巢[2-4]，参与受损部位的血管发生和血管生成，而且很少整合至正常血管组织内。越来越多的研究认为，EPCS可能会成为新一代理想的再生医学工具或者基因治疗肿瘤的载体，为靶向性治疗提供可能性。SPIO作为MR阴性标记物标记移植细胞，可以为EPCS移植的MRI示踪奠定基础。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂、仪器
SD大鼠，体重120～150g，雌雄不拘，清洁级，由山西医科大学实验动物中心提供。
超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Schering公司，德国），淋巴细
大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测
崔碧，李健丁，张瑞平
山西医科大学第一医院影像科，山西太原030001
[摘要]目的：研究大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCS）的分离、培养、SPIO标记，SPIO对EPCS的标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响，为进一步的实验研究奠定基础。方法：SD大鼠体重120～150g，采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠EPCS，采用25μg/ml SPIO对其标记，比较标记和未标记的EPCS。普鲁士蓝染色观察铁标记率，台盼蓝检测细胞活力，MTT法检测细胞增殖力，Calcein-AM/PI染色检测细胞活性及细胞膜完整性，AO/PI染色检测细胞凋亡率。结果：分离培养EPCS7～10d，细胞集落相互连接，呈典型的铺路石样外观。普鲁士兰染色显示SPIO（25μg/ml，24h）对细胞的标记率接近94%；比较SPIO标记及未标记的EPCS，细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%；MTT法检测两组间相比差异无统计意学义（P＞0.05）；Calcein-AM/PI染色检测细胞的活性和膜完整性，存活率分别为96%和97%；AO/PI染色两组细胞的凋亡率均为5%。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞，经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养。25μg/ml浓度的SPIO细胞标记率高，对细胞毒性小，且不影响EPCS的活力、增殖及凋亡。
[关键词]内皮祖细胞；骨髓；超顺磁性氧化铁颗粒；标记
[中图分类号]R73-351[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）03（c）-033-04 Rat bone endothelial progenitor cells labeled with superparamagnetic iron oxide particles and the detection
CUI Bi,LI Jianding,ZHANG Ruiping
Department of Radiology,the First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China
[Abstract]Objective:To study the isolation,culture,SPIO mark of the rat bone marrow progenitor cells(endothelial progenitor cells,EPCS),and observe whether there is any effect on cellular viability,proliferation and apoptosis.which lay the foundation for future experimental studies.Methods:The EPCS were collected from bone marrow of rats (weighing120-150g)and cultured.EPCS were obtained by density gradient centrifugation and adhesive-screening methods and labeled with25μg/ml SPIO.Marked and unlabeled groups were compared.Prussian blue staining was used to identify labeling index,Trypan blue staining was employed to detect cell vitality,MTT assay was utilized to detect proliferation activity of stem cells,Calcein-AM/PI staining cell was detected cell activity and membrane integrity,AO/PI staining was detected cell apoptosis.Results:Cell Colonies were connected,showing the typical cobblestone appearance on the7-10d.
Prussian blue staining showed that SPIO(25μg/ml,24h)of cells labeled rate of close to94%;compared SPIO labeled and unlabeled EPCS,cell viability was94.34%±0.25%and95.33%±0.31%;MTT assay detected that there was no statistical difference between the groups compared with Italy in righteousness(P＞0.05);Calcein-AM/PI staining cell activity and membrane integrity,survival rates were96%and97%;AO/PI staining cells withered groups death rate was5%.Conclusion: Gradient centrifugation from bone marrow mononuclear cells can be achieved by induction of endothelial progenitor cells, isolated and cultured;25μg/ml high concentrations of SPIO cell labeling dose not affect the EPCS viability,proliferation and apoptosis.
[Key words]Endothelial progenitor cell;Bonem arrow;Superparamagnetic iron oxid;Labeling
[基金项目]山西医科大学青年科技研究基金（项目名称：SPIO标记干细
胞移植治疗兔脊髓损伤的MR活体示踪；项目编号：2010021038-2）。
[作者简介]崔碧（1984-），女，山西医科大学2008级在读硕士；研究方
向：腹部影像。
[通讯作者]李健丁（1951-），男，本科学历，山西医科大学第一医院影像
科主任，教授；研究方向：腹部影像。
·短篇论著·2011年3月第8卷第9期
胞分离液、台盼蓝、胰蛋白酶（Sigma公司，美国），DMEM/L （Hyclone公司，美国），FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司），VEGF，bFGF（Peprotech公司，英国），多聚甲醛（天津傲然精细化工研究所），钙黄绿素（Calcein-AM）、碘化丙啶（PI）（日本同仁化学研究所），倒置显微镜（Leica公司，德国），激光共聚焦显微镜（OLYMPUS，日本），CO2培养箱（SIM公司，美国）。
1.2细胞的提取、分离与培养
大鼠断颈处死后，置于75%酒精浸泡灭菌5min。无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨，去除肌肉组织，用注射器吸取PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，充分冲出骨髓组织后收集至离心管中。将冲洗液沿管壁缓缓加入盛有分离液的离心管内（两者体积比为1∶1），动作宜轻柔，勿使其与分离液混合，水平离心，2000r/min离心30min，将离心后的白雾状细胞层小心吸出来，用PBS液洗涤3次，应用DMEM/L培养基[含体积分数15%胎牛血清，bFGF和VEGF终浓度均为10ng/ml，青霉素（100U/ml），链霉素（0.1g/L）]，接种于预铺有纤连蛋白3.5cm培养皿中，置入在10％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中。72h后进行第1次半量换液，洗去未贴壁细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，以后根据培养基变化情况每2～3天全量换液。
1.3EPCS的磁标及观察
SPIO标记细胞，细胞培养8天，加入终浓度25μg/ml的SPIO，置于培养箱内孵育24h，用PBS洗涤3次，去除未进入细胞的铁离子。
1.3.1标记率测定普鲁士蓝铁染色，细胞爬片后用4％多聚甲醛固定30min，倒掉后PBS冲洗3次，晾干后加入新鲜Perls溶液（A液：2%亚铁氰化钾；B液：2%盐酸；临用前A、B 液等量混合，静置3min），置培养箱孵育30min，PBS冲洗3次，加入0.5%中性红水溶液对比染色10min，PBS洗涤3次。光镜下观察核呈红色，Fe3+呈蓝色，表明标记成功并计算胞浆内存在蓝色颗粒的细胞数量和比例。
1.3.2台盼蓝染色检测细胞活力标记细胞消化离心后制成细胞悬液，取90μl悬液和10μl台盼蓝染液混匀，细胞计数板与盖玻片上、下两侧各加10μl混匀液，镜下观察，计数100个细胞，细胞活力=染色阴性细胞数/100个细胞×100%。未标记组方法同上，倒置显微镜下分别于细胞标记后7d行细胞活性检测。
1.3.3MTT法检测细胞增殖力消化EPCS后接种于96孔板中，每孔体积200μl，细胞数为1×106个/ml。标记组和未标记组每组24孔细胞，以纯培养基空白对照，培养1、3、5、7d后相同时间每组各取6孔细胞，加入20μl MTT液（5g/L）孵育4h后，吸弃孔内培养基，向每孔加入200μl二甲基亚砜，轻轻振荡10min充分溶解细胞代谢产物，以空白孔调零后求出各孔吸光度值，用酶标仪检测590nm吸光度值A590。1.3.4AO/PI染色检测细胞凋亡率用10ml PBS溶解AO原粉100mg制备成1%的AO母液；1ml ddH2O溶解1mg PI，制备成1.5mmol/L的PI储备液（1mg PI/1ml H2O）（-20℃下避光冷冻保存）。细胞染色前加1ml AO母液和1ml PI储备液至8ml PBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞，各培养皿中加入100μl染液，37℃温孵10min后，用PBS洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察，每皿随机取至少3个无重叠视野拍照计数。试验重复3次。AO能透过细胞膜而嵌入双链DNA使之呈现绿色，PI仅能透过破损的细胞膜嵌入DNA使之呈现红色。在激光共聚焦显微镜下观察，细胞凋亡率计算公式：细胞凋亡率=凋亡细胞／（活细胞+凋亡细胞+膜破损细胞）×100％。
1.3.5Calcein-AM/PI染色检测细胞存活率用1ml无水DMSO溶解1mg Calcein-AM制备成1mmol/L的Calcein-AM 储备液；1ml ddH2O溶解1mg PI，制备成1.5mmol/L的PI 储备液（1mg PI/1ml H2O）。细胞染色前加10μl Calcein-AM 储备液和15μl PI储备液至5ml PBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞，用PBS洗涤数次，每皿加入100μl 染色溶液，在37℃下孵育15min。在激光共聚焦显微镜下观察，先用（490±10）nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以观察到红色的死细胞，然后用545nm波长激发，能够看到红色的死细胞。每皿随机取至少3个无重叠视野拍照计数，试验重复3次。
1.4统计学方法
全部数据采用SPSS13.0统计软件进行处理。检测数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1EPCS形态学观察
接种初期的EPCS为圆形，体积较小，生长速度较慢。4d 后细胞生长明显加速，大多数细胞呈短梭形，并可见细胞形成集落，7d后大多数混杂细胞脱落，梭形细胞呈优势生长（图1）。至第10天，梭形细胞继续增多，可见特异性索条状结构或铺路石样排列。
图1EPCS原代培养8d（倒置相差显微镜×100）
2.2SPIO标记率测定
标记的EPCS光镜下观察，胞浆内可见棕色铁颗粒浓聚，经普鲁士蓝染色后在光镜下观察，细胞内可见大量蓝染的铁颗粒，在铁浓度为25μg/ml条件下，细胞形态同未标记细胞无明显差别，大部分细胞的胞浆内可见蓝染颗粒，标记的效率接近94%（图2）。当浓度＞75μg/ml的条件时，大部分细胞皱缩、漂浮于培养基中，细胞胞浆内充满高浓度深染颗粒。
2011年3月第8卷第9期
·短篇论著·
（下转第63页）
2.3标记细胞台盼蓝染色
倒置显微镜下细胞计数，SPIO 标记及未标记的EPCS 细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%，两组间比较差异无统计学意义（P ＞0.05），可见25μg/ml 超顺磁性氧化铁颗粒标记细胞后不会影响细胞的活力。2.4MTT 法检测细胞增殖活力
MTT 法检测标记的细胞与未标记细胞分别在1、3、5、7d 测得的OD 值比较，两组之间差异无统计学意义[（0.2315±0.0462），（0.2438±0.0415）；（0.3790±0.0301），（0.3589±0.0302）；（0.3942±0.0472），（0.4034±0.0309）；（0.4626±0.0327），（0.4531±0.0268）；P ＞0.05]，这表明超顺磁性氧化铁标记细胞
对其增殖活力无影响，无毒性作用。
2.5AO/PI 染色检测细胞的凋亡率
AO/PI 染色后凋亡细胞核染色质显现绿色并呈固缩状
或片段状；活细胞核染色质着绿色并呈正常结构；膜破损细胞，核染色质着红色。标记细胞组（图3）与未标记细胞组每组细胞取3个视野计数，重复3次，两组凋亡率均为5%，说明细胞标记后对其凋亡能力无影响。
图3
标记细胞AO/PI 染色（激光共聚焦显微镜×200）
2.6Calcein-AM/PI 染色检测细胞存活率
Calcein-AM/PI 染色后存活细胞胞浆呈现绿色，死细胞胞核呈现红色，标记细胞组（图4）与未标记细胞组细胞存活率均值分别为96%和97%，说明细胞标记后对其存活率无影响。
3讨论
EPCS 是能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟的血管内皮细胞表型的前体细胞。在胚胎第15天左右，卵
黄囊胚外中胚层的细胞聚集成细胞团形成血岛。多个血岛融合形成原始的血管，这些血管建立了最初的毛细血管网结构。血岛中央的细胞为造血干细胞，周边的细胞为EPCS [5]。研究证实，在成年动物的骨髓、脐血、外周血中都存在有EPCS ，作为实验研究，大鼠骨髓容易获得，无需特殊处理，操作简单且EPCS 含量丰富。原代EPCS 培养过程中要注意以下两点：
①无菌操作是关键；②操作过程动作宜轻柔，细胞贴壁前避
免剧烈移动培养皿。
磁共振细胞成像可以被简单的定义为活体组织内靶向细胞和细胞行为的非侵入性和可重复性成像，是分子影像学在细胞水平的拓展和延伸，它的出现为示踪移植细胞提供了新的途径[6]。高分辨MRI 是干细胞检测和示踪的理想手段[7-8]，外源性移植细胞必须标记磁共振对比剂，这样才能将细胞从其周围的组织中分辨出来。SPIO 是目前MRI 成像应用较广泛的对比剂，SPIO 用于干细胞标记剂量越大，孵育的时间越长，标记水平越高，但是过多的铁会影响细胞的生物学活性及其增殖能力[9]。因此，选择适宜浓度的SPIO 标记意义重大。
Arbab 等[10]研究表明，25μg/ml SPIO 标记不影响细胞的生物活性，且可获得较好的标记效果，而50μg/ml SPIO 标记影响细胞生物活性。因此，本研究采用25μg/ml SPIO 标记，结果表明：该标记方法可达到94％的标记率，且细胞的活力及增殖能力均不受影响，进一步说明了适量SPIO 标记不影响EPCS 的生物学特性。
干细胞移植治疗疾病已成为临床研究的热点。本实验采用了简单实用的方法从大鼠骨髓中分离、诱导，并在体外成功培养出EPCS ，采用多种手段、多个方面地观察标记后细胞的生物学特性，并证明了该标记不影响其活性、增殖以及凋
亡等，为今后EPCS 的下一步进行活体示踪实验奠定了重要实验基础。
[参考文献]
[1]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor
endothelial cells for angiogenesis [J].Science,1997,275(5302):964-967.
2011年3月第8卷第9期
·制剂与技术·
1
H NMR （CDCl 3）δ：9.57（b ，1H ，N 3-H ）；9.08（b ，1H ，N 3-H ）；8.59（d ，J=6.6Hz ，1H ，C 6-H ）；3.47（q ，2H ，C 9-H ）；1.37（m ，8H ，C 10～13-H ）；0.94（t ，3H ，C 14-H ）。元素分析理论值（%）：C 51.44，H 6.38，N 16.38；实测值（%）：C 51.39，H 6.36，N 16.35。MS （m/z ）：257[M +]。2.3结果
合成（2）时，尿素-甲醇-无水氯化锌-嘧啶的摩尔之比为1∶24∶0.6∶4。尿素的用量为12.0g ，甲醇的用量为480ml ，反应压力为0.3MPa ，温度为160℃，反应时间3h 。
合成（3）时，5-氟尿嘧啶-化合物（2）-嘧啶的摩尔之比为1∶1.5∶6.3。5-氟尿嘧啶的用量是7.8g ，反应温度为95℃，反应时间2h 。总收率为83.4%。
本文对合成的原料配比工艺参数进行摸索，见表1。甲
醇的用量对反应收率的影响，以无水氯化锌为催化剂，在上述相同反应条件下改变甲醇用量，结果见表1。
表1
甲醇的用量对反应收率的影响
Tab.1Amount of methanol on the reaction yield 由表1可知，随着甲醇用量的增加，收率有所提高，但其用量达到480ml ，尽管收率还会提高，但提高的幅度较小，
且反应量增加的同时，反应容器的负荷也会相应的增加。故选择摩尔比尿素-甲醇=1∶24。
3讨论
本实验以价格低廉、易得的尿素、甲醇为起始原料。在制备中间体（2）的反应中，甲醇既作为溶剂，又作为反应物参与反应，由于该反应的主要副产物为己基脲和甲醇，故增加甲醇的用量可减少副反应的发生，提高尿素的转化率和选择性；因为无水氯化锌是路易斯酸，具有亲电性，故使用无水氯化锌做催化剂可降低反应温度，缩短反应周期；利用嘧啶的亲核性，可以抑制尿素的分解，从而提高中间体（2）的收率；中间体（2）与5-氟尿嘧啶缩合反应，加入适量的DMAP 并提高反应温度可使反应时间缩短，反应更趋于完全。
反应中回收了过量的甲醇，回收的甲醇经处理后可循环利用，大大减少了废液的产生，降低了成本，符合绿色环保的要求，易于大生产操作。
[参考文献]
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（收稿日期：2011-01-07）
16.216.216.216.216.2
240360480600720
收率（%）
48.370.589.192.895.6
12345
12.012.012.012.012.0
顺序
甲醇（ml ）
无水氯化锌（g ）
因素尿素（g ）
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（收稿日期：2011-02-16）
（上接第35页）
进病灶修复[10]。所以，监测血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平有助于判断脑梗死的预后；应用复方地龙胶囊治疗可以显著降低患者血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平，从而减轻脑组织损伤，有利于脑梗死患者的转归。
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（收稿日期：2010-12-27）
（上接第32页）
大鼠胰岛细胞原代培养
大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。 我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。方法是我根据文献稍作改动后实施的。胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。 溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。没有红染的细胞就是没有胰岛啊。还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧 大鼠胰岛细胞原代培养 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks 悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞， 胰岛细胞移植的研究进展 人类至今已有100多年用移植方法治疗糖尿病的历史，胰岛细胞移植治疗糖尿病存在两个障碍：组织来源不足和免疫排斥反应。 一．胰岛细胞的来源
第九章 内皮祖细胞
第九章内皮祖细胞 内皮祖细胞（EPC）是一类能循环、增值并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。广义上认为EPC包括从血液血管干细胞分化为成熟内皮细胞的过程中所有一系列细胞。 第一节内皮祖细胞的分类与来源 一分类 从外周血中分离单细胞进行体外培养，3--5天后出现纺锤体形细胞，在2---3周生长达到高峰，在第4周死亡，称为早期EPC； 另一种细胞在第2---4周出现，成鹅卵石形，在4---8周呈指数生长，可存活12周，称为晚期EPC。 早期EPC主要存在于骨髓中，主要表面标记是CD133（AC133）、CD34、VEGFR-2 晚期EPC强表达所有内皮系标记VE-cadherin、FL T-1内皮一氧化氮合酶、CD31等。 二来源 EPC的来源主要有一下几种 1.血液血管干细胞 根据 （1）
造血干细胞（HSC）血细胞成分 血岛（卵黄囊的腹侧） 血管内皮前体细胞血管内皮细胞（原始毛细血管网） (2)原始的HSC和EPC享有共同的细胞表面标志CD34、AC133、血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2） (3)HSC存在的部位如骨髓、外周血、新生儿脐带血、胎儿肝、胎儿脾均已证实含有EPC。 2.髓系祖细胞 髓系祖细胞是单核细胞和巨噬细胞定向分化的前体细胞。然而，许多实验表明，在血管生成的培养条件下，髓系CD34-/CD14+单核细胞能够表达许多内皮细胞的特异标志，并可在体外形成网状结构。 成熟的CD34-/CD14+外周血单核细胞在VEGF诱导下也能分化为内皮细胞样细胞，这些细胞同时表达内皮细胞标记。把这些细胞和CD34+细胞一起注入体内时，发现他们能够结合到新生血管的管壁中去。这一实验表明不仅CD34+细胞能分化成内皮细胞，CD34-/CD14+单核细胞能够分化为有生理功能的血管内皮细胞，并可作为EPC的来源。 3.多潜能成体祖细胞 许多成体组织存在少许MAPC。在细胞因子的诱导下，MAPC可在体外分化为内、中、外各胚层，在特定组织中定向分化为相应的干细胞。目前，成体造血组织骨髓中已被证实存在MAPC，体内外研究证实MAPC细胞可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞。心脏组织残留的MAPC也成功分离，研究显示
大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养及鉴定_陆耀良
第23卷第6期2013年11月江苏大学学报（医学版） Journal of Jiangsu University （Medicine Edition ）Vol．23No．6Nov．2013 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养及鉴定 陆耀良1，康涛1，李晓强2，韩松 1 （1．苏州大学附属太仓医院血管外科，江苏苏州215400；2．苏州大学附属第二医院血管外科，江苏苏州215004） ［摘要］目的：探讨内皮祖细胞（endothelial progenitor cells ， EPCs ）分离培养鉴定方法及其生物学特性。方法：采用梯密度离心法结合差速贴壁法分离获取大鼠骨髓单核细胞，培养于EGM-2-MV-SingleQuots 内皮细胞培养液中，分别取48h 内贴壁细胞（早期EPCs ）和48h 后贴壁细胞（晚期EPCs ），在倒置显微镜下观察细胞形态，应用流式细胞术鉴定EPCs 表面抗原标志CD34，CD133和血管内皮生长因子受体-2（VEGFＲ-2），激光共聚焦检测EPCs 吞噬功能，透射电镜观察EPCs 内部超微结构。结果：单核细胞接种后呈小圆形，早期EPCs 呈长梭形，晚期以纺锤形为主，培养7d 后有明显干细胞集落；增殖至第6代以后，形态开始逐渐接近于内皮细胞，并出现管腔样结构。内皮祖细胞表面标志CD34，CD133和VEGFＲ-2均呈阳性表达，能吞噬Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白并结合FITC 标记的凝集素-1。透射电镜可观察到内皮细胞特征性细胞器Weible-Palade 小体。结论：梯密度离心法结合差速贴壁法能够成功地从骨髓中分离、 纯化、培养出内皮祖细胞，其增殖能力强，数量充足，生物学特性稳定。［关键词］内皮祖细胞；骨髓；干细胞［中图分类号］Ｒ329．2 ［文献标志码］A ［文章编号］1671－7783（2013）06－0465－05 ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30972941）［作者简介］陆耀良（1968—），男，江苏太仓人，副主任医师，硕士，主要从事血管外科基础与临床研究；李晓强（通讯作者），教授，博士生 导师 ，E-mail ：bright612@163．com Isolation ，culture and identification of rat bone marrow derived endothelial progenitor cells LU Yao-liang 1，KANG Tao 1，LI Xiao-qiang 2，HAN Song 1 （1．Department of Vascular Surgery ，the Affiliated Taicang Hospital of Soochow University ，Suzhou Jiangsu 215400；2．Department of Vascular Surgery ，the Second Affiliated Hospital of Soochow University ，Suzhou Jiangsu 215004，China ） ［Abstract ］Objective ：To explore the culture ，differentiation and identification method and biological characteristics of the rat bone marrow derived endothelial progenitor cells （EPCs ）．Methods ：We separated the rat bone marrow mononuclear cells using density gradient centrifugation combined with differential side-wall separation ，cultured endothelial cell with EGM-2，obtained adherent cells within 48h （early EPCs ）and adherent cells after 48h （late EPCs ），respectively．The cell morphological images were observed under inverted microscope ；EPCs surface antigen markers ，CD34，CD133and VEGFＲ-2were identified by the flow cytometry ，the phagocytosis of EPCs were detected by laser scanning confocal microscope ，the internal ultrastructure of EPCs were observed by transmission electron microscope．Ｒesults ：Mononuclear cells were small round after the first incubation ，the late EPCs was given priority to spindle-shaped ，and there was ob-vious stem cell colony after culture in 7days ；till the 6th generations of EPCs ，the cellular morphology was gradually close to the endothelial cells ，appeared the tube cavity structure．CD34，CD133，VEGFＲ-2ex-pressed positive ，could absorb Dil-ac-LDL combined with FITC-UEA-1．There was characteristic organelles Weible-Palade （W-P ）small body in the EPCs under inverted microscope．Conclusion ：The EPC was suc-cessfully isolated from bone marrow ，and purified ，cultured by density gradient centrifugation combined with differential adherent method ；it had strong proliferation ability ，abundant cell count and stable biological characteristics． ［Key words ］endothelial progenitor cells ；bone marrow ；stem cells DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.2013.06.003
小鼠脑动脉血管平滑肌细胞使用说明
小鼠脑动脉血管平滑肌细胞 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
大鼠二型糖尿病造模方法
大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020
大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病 （Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良解读
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良 [ 08-10-30 13:48:00 ] 作者：吴建芳编辑：studa20 【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98% 以上，足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士 【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养 Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity. Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。 1 材料与试剂 1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。 1．2 试剂：鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。 1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。 1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)，过滤除菌即用。
血管内皮祖细胞治疗缺血性心脏病的研究进展
匡堂绽述；Ｑ堕生！旦筮！！鲞箜！！翅丛型垫尘曼塑塑ｉ坐丛！：墅Ｐ！Ｑ塑：！生：！！：盟！：！！ ［１１］［１２］［１３］［１４］［１５］ＶａｎＩｔａｌｉｉｅＣＭ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＪＭ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｇｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｐｏｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），２００４，１９（６）：３３１－３３８． ＡｎｇｅｌｏｗＳ，ＡｈｌｓｔｒｏｍＲ，ＹｕＡＳ．ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｅｌａｕｄｉｎｓＪＩ．ＡｍＪ ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００８，２９５（４）：８６７－８７６． ＡｒｒｉｅｔａＭＣ．ＢｉｓｔｒｉｔｚＬ．ＭｅｄｄｉｎｇｓＪＢ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｏｒ－ ｍｅａｂｉｌｉｔｙｌＪ１．Ｇｕｔ，２００６，５５（１０）：１５１２．１５２０． ＶａｌｌＩｔａｌｌｉｅＣＭ．ＡｎｄｅｒｓｏｎＪＭ．Ｃｌａｕｄｉｎｓａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｉｌｓ．Ⅳ，ｒｔｌＪＩ．ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｓｉｏｌ，２００６，６８（３）：４０３－４２９． ＢａｌｋｏｖｅｔｚＤＦ．Ｔｉｇｈｔｉｕｎｃｔｉｏｎｃｌａｕｄｉｎｓａｎｄｔｈｅｋｉｄｎｅｙｉｎｓｉｅｋｎｅｓ６ ａｎｄｉｎｈｅａｌｔｈ【Ｊ】．ＢｉⅢ?ｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２００８．７（４）：１０１６． ＷｉｌｌＣ。Ｆｎｍ，ｌｍＭ，Ｍｔｉｌｌｅｌ＂Ｄ．Ｃｌａｎｄｉｎｔｉｇｈｔｉｕ／Ｒｍｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｎｏｖｅｌａ８． ｐｅａｓ ｉｎｐａｒａｅｅｌｈｌａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔ［Ｊ］．ＰｅｔｉｔＤｉａｌＩｎｌ，２００８，２８（６）：５７７－５８４． ＮｉｔｔａＴ。ＨａｔｓＭ，ＧｏｔｏｈＳ。ｅｔａ１．Ｓｉｚｅ．ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｏｏｓｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅ ｂｋｘＭ—ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｉｎｃｌａｕｄｉｎ－５．ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅＪｆ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ， ２００３．１６ｌ（３）：６５３－６６０． ＨｏｕＪ，ＧｏｍｅｓＡＳ，ＰａｕｌＤＬ。ｅｔａ／．Ｓｔｕｄｙｏｆｃｌａｎｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ眦～ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ｛Ｊ１．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００６，２８ｌ（４７）：３６１１７．３６１２３． ＶａｎＩｔａｌｌｉｅＣＭ，ＨｏｌｍｅｓＪ，ＢｒｉｄｇｅｓＡ．ｅｔ ａ１．ＴｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｓｎｌｕＵ ｔｉｇｈｔｉｕｎｃｔｉｏｎｐｏｒｅｓｖａｒｉｅｓａｍｏｎｇｃｅｌｌｔｙｐｅｓａｎｄｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｅｘ． ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌａｕｄｉｎ－２［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＳｃｉ，２００８。１２１（Ｐｔ３）：２９８－３０５． ＳｉｍｏｎＤＢ，ＬｕＹ，ＣｈｏａｔｅＫＡ，ｅｔａ１．Ｐａｒａｃｅｌｌｉｎ—１．ａｒｅｎａｌｔｉｇｈｔｉｕｎｅ． ｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐａｒａｅｅｌｌｕｌａｒＭ９２＋ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９。２８５（５４“）：１０３一１０６． ＳｏｎＳ，ＫｏｊｉｍａＴ，ＤｅｃａｅｎｓＣ，ｅｔａ１．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｔｉｓｈｔｉｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌａｕｄｉｎ－２ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｉｌｅｃａｎａｌｉｃｕｌａｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＷＩＦ—Ｂ９ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＨｉｓｔｅｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００９，１３ｌ（３）：４１１４２４． ＤｅｃａｅｎｓＣ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＰ，Ｂｏ血ｈａｕｄＣ．ｅｔａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｈｅ． ｐａｔｉｏｃｅｌｌｐｏｌａｒｉｔｙｉｎｔｈｅｒａｔｈｅｐａｔｏｎｍ—ｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｈｙｂｒｉｄ ＷＩＦ—Ｂ９．Ａｂｉｐｈａｓｉｃｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｇｏｉｎｇ ｆｒｏｍａ ｓｉｍｐｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐｏ． １ａｒｉｚｅｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｔｏａｎｈｅｐａｔｉｃｐｏｌａｒｉｚｅｄｏｎｅ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＳＣｉ，１９９６， ［１６］ ［１７］ ［１８］ ［１９］ ［２０］ ［２１］ ［２２］ ［２３］ ［２４］ ［２５］ ?２７５３? １０９（Ｐｔ６）：１６２３－１６３５． ＤｅｃａｅｎｓＣ。ＤｕｒａｎｄＭ。Ｇｌ＇ＯＳｓｅＢ，ｅｔ ａ／．骶ｉｃｈｉｌｔｉｖｉｔｒｏｍｏｄｅＩｓｃｏｕｌｄ ｂｅｂｅｓｔｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｐｏｌａｒｉｔｙ？［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｅｌｌ，２００８， １００（７）：３８７－３９８． Ｈａｄｊ．ＲａｂｉａＳ，ＢａｈｉａＬ，Ｖａｂ№Ｐ，ｅｆａ／．Ｃｌａｕｄｉｎ．Ｉｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｎｅｏｎａｔａｌｓｃｌｅｍｓｉｎｇｅｈｏｌａｎｇｉｔｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｃｈｔｈｙｏｓｉｓ：ａｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｄｉｓｅａｓｅ【Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。２００４，１２７（５）；１３８６一１３９０． ＴａｍｏｒａＡ。ＫｉｔａｎｏＹ．ＨａｔａＭ．ｅｔ ａ１．Ｍｅｇａｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｉｎｃｌａｕｄｉａ—１５一 ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００８，１３４（２）：５２３－５３４． ＺｈａｏＪ，ｄｅＶｅｒａＪ。ＮａｒａｓｈｉｍａＳ，ｅｔａ１．Ｒ—ｓｐｏｎｄｉｎｌ．ａｎｏｖｅｌｉｎｔｅｓｔ／． ｎｏｔｒｏｐｈｉｅｍｉｔｏｇｅｎ，ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。２００７，１３２（４）：１３３１．１３４３． ＪｏＶＯＶＢ，ＶａｎＩｔｌｌｉｅＣＭ，ＳｈａｈｅｅｎＮＪ，一ａ１．Ｃｌａｎｄｉｎ—ｌ８：ａｄｏｍｉｎａｎｔ ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓａｎｄｌｉｋｅｌｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ ｔｏｉｔｓａｃｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈ【ｙｓｉｏｌＧａｓｔｍｉｎｔｅｓｔＬｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌ。 ２００７．２９３（６）：１１０６．１１１３． ＦａｓａｎｏＡ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆｚｏｎｕｌｉｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ：ｌｉｖｉｎｇｌｉｆｅｏｎｔｈｅ ｅｄｇｅｏｆｔｈｅｗａｌｌ［Ｊ］．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ。２００８。１７３（５）：１２４３?１２５２． ＶａｌｌＩｔａｌｌｉｅＣＭ．ＢｔｔｓＬ．ＳｍｅｄｌｅｙＪＧ．村ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｌａｕｄｉｎ． ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｆｆｒｉｎｇｅｎｓｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８，２８３（１）：２６８－２７４． ＴｓｕｋｉｔａＳ．ＦｕｒｕｓｅＭ．Ｃｌａｕｄｉｎ．ｂａｓｅｄｂａｒｒｉｅｒｉｎｓｉｍｐｌｅａｎｄｓｔｒａ！ｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｓｈｅｅｔｓ【Ｊ］．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉ０１．２００２．１４（５）：５３ｌ－５３６． Ｆｕ兀ｌｓｅＭ，ＨａｔａＭ，ＦｕｍｓｅＫ，ｅｔａ／．Ｃｌａｎｄｉｎ—ｈａｓｅｄｔｉｇｈｔｊｔｉｌｌ（－ｔｉｏｎｓ瓣 ｃｒｏｃｉａｌｆｏｒｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｔｍｒｔｉｅｒ：ａＩｅｔＫｓｏｎｆｒｍｎｃｌａｕｄｉｎ．１．ｄｅ－ ｆｉｃｉｅｎｔｎｆｉｃｅＩＪ】．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１１２，１５６（６）：１０９９一１１１１． ＮｌｅｓｓｅｎＣＭ．Ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｓ／ａ，ｔｈｅｒｅｎｓｉｕｎｃｔｉｏｎｓ：ｂａｓｉｃｓｌｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄｆｕｎｏｔｉｏｎ【ＪＩ．ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ，２００７．１２７（１１）：２５２５．２５３２． 收稿Ｕ期：２００９旬３－２３修同日期：２００９－０７－０２血管内皮祖细胞治疗缺血性心脏病的研究进展 陈闽荔’，张金莲△（综述），吕建国（审校） （天津市胸科医院心内科，天津３０００５１） 中圈分类号：Ｒ５４１文献标识码：Ａ文章编号：１００６－２０８４（２００９）１８－２７５３－０４ 摘要：内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，是一类能够迁移、增殖，并分化为成熟血管内皮细胞 的前体细胞，属于干细胞群体，参与人胚胎血管生成及出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程，还可在一定条件下分化为心肌细胞。近年来的研究表明其与冠心病发生、发展及治疗的关系密切，为冠心病治疗提供了新思路。本文就内皮祖细胞的生物学特性及其在缺血性心脏病中的临床研究现状予以综述。 关键词：内皮祖细胞；缺血性心脏病；治疗；细胞移植 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｂｏｕｔＥｎｄｏｔｈｅｌｌａｌＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒＣｅｌｉｓｉｎＴｒｅａｔｉｎｇｌｓｃｈｅｍｉｃＨｅａｒｔＤｉｓｅａｓｅＣＨＥＮＭｉｎ．１ｉ．ＺＨＡＮＧＪｉｎ?ｌｉａｎ，ＬＶＪｉａｎ－ｇｕＤ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｅｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴ／ａ彬ｎ，‰ｎｊｉｎ３０００５１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｉｓｔｈｅｐｍｃｅｌｌｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ｗｈｉｃｈＣａｌｌｍｉｇｒａｔｅ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｅｔｈｅｐｒｏｃｅｌｌｏｆｍａｔｕｒｅｔＩｒｅｓｓｅｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｅｅｌＩｓ．Ｔｈｅｙｂｅｌｏｎｇｔｏｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｗｈｉｃｈｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｎｏｔｏｎｌｙｔｈｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｖａｓｅｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ。ｂｕｔａｌｓｏｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓａｆｔｅｒｂｅｍａｎｄｒｅｐａｉｒｐｒｏｃｅｓｓａｆｔｅｒｅｎｄｏ．ｔｈｅｌｉａｌｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅｒｅｃｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｓｈｏｕｌ‘ＪｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏＣｏｍｎａｒｙ ｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅｃｌｏｓｅｌｙａｂｏｕｔｉｔｓｇｅｎｅｓｉｓ．ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｒａｐｙ．ＥＰＣｐｒｅｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗｉｄｅａｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｏｒｏｎａｒｙｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ；Ｉｓｅｈｅｍｉｅｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ；Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ 缺血性心脏病（ｉｓｅｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ，ＩＨＤ）是由 于冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流和心肌需求 之间不平衡而导致的心肌损害，在急性缺血时，心肌 细胞在短时间内大量凝固性坏死；慢性长期血供不 足使心肌组织发生营养障碍和萎缩，残余的心肌细 胞无法莺建坏死的组织，心脏功能随着时间进行性 恶化，其中最常见的原因是冠心病，约占９０％。ＩＨＤ 是严重危害居民健康的多发病和常见病，是慢性心 力衰竭的主要原因，传统的治疗手段主要是重建血供，而不能修复损伤和坏死心肌。近几年兴起的干细胞移植治疗ＩＨＤ不仅可以再生血管，而且可以再生心肌，使人们看到了新的希望。血管内皮前体细胞或血管内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉ－ｔｏｒｃｅｌｌ。ＥＰＣ）是成熟血管内皮细胞的前体细胞，能够特异性归巢于血管新生组织并分化为血管内皮细胞，属于干细胞群体，既可自我更新 又能定向分化为成熟的血管内皮细胞，参与血管再 生和损伤血管的再内皮化，还可在一定条件下分化 为心肌细胞，具有重要的生理和病理意义，也为缺血 性心脏疾病的治疗提供了新策略…。 １ＥＰＣ概述 １．１ＥＰＣ的来源胚胎期第１３～１５天，胚外造血 启动，卵黄囊的胚外中胚层的一些间充质细胞逐渐 聚集成条索或团块状，形成血岛。这些细胞团结构 进一步出现腔隙化改变，聚集在细胞群中央的细胞…㈨㈨………州 万方数据
大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良
大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良 中国医科大学附属第一医院内分泌科(沈阳110001) 吴志香* 王玉霞△ 刘国良 摘 要 目的:探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。方法:运用胶原酶 原位灌注法分离胰腺, F ico ll400纯化胰岛细胞,双硫腙(D T Z)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态, 放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。结果:每只大鼠可分离438±27个胰岛 胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GS IS实验中胰岛素释放指数S I为3.25±0.26。结论:本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件。 主题词 细胞培养 胰岛 生理学 胰岛 分离和提纯 大鼠 An i m provem en t m ethod of pr i m ary culture of w istar ra t pancrea tic islets D ep artm en t of Endocrino logy,the F irst A ffiliated Ho sp ital,Ch ina M edical U n iversity (Shenyang 110001)W u Zh ix iang W ang Yux ia L iu Guo liang ABSTRACT O b jective:To study the effects of iso lating and cu ltu ring the rat pancreatic islets in vitro.M ethods:A fter in traductal infu si on of8210m l co ld H ank’s balanced so lu ti on con tain ing1m g m l of type co llagenase,pancreas w ere su rgically p rocu red and digested at37℃fo r15220m in,and stopped digesti on by co ld H ank’s so lu ti on w hen the em u lsi on appeared.T he islets w ere pu rified by discon tinou s F ico ll den sity gradien t(25%,23%,20.5%and11%)cen trifugati on,and the degree of pu rity w as defined as dith izone stain ing.A n i m ati on of islets w as ob served and in su lin secreti on w as detected. R esu lts:438±27islets w ere p rocu red from one rat,and su rvival rate w as92.3±2.3%,Gluco se sti m u lated in su lin secreti on in vitro show ed the m ean value of in su lin in the low2gluco se m edium w as39.74±2.73mM ,w h ile that of h igh2gluco se m edium w as128.94±8.72mM,the S I w as3.25±0.26.Conclu si on:T h is m ethod cou ld ob tain large quan tities and h igh quality islets,w h ich offered better experi m en tal conditi on s fo r cell study. KEY WORD S Cell cu ltu re Istets of langerham s physi o logy Istets of langerham s iso lati on pu rificati on R ats 近年来许多有关糖尿病方面的研究均利用体外培养的胰岛细胞株作为研究对象,然而源自肿瘤细胞系的细胞株毕竟在基因表达功能上与正常细胞有差别,因此,本研究采用了培养的大鼠原代胰岛细胞作为研究对象,以期更接近在体研究的结果,同时又可避免在体研究很难避免的混杂因素。 材料与方法 1 实验材料 实验动物选择两月龄的健康W istar大鼠,体重250±23g,购自中国医科大学实验动物中心。主要试剂有 型胶原酶(co llagenase typ e ,Sigm a);R PM I1640及 *辽宁中医药大学附属第一医院 △中国医科大学附属第四医院DM E M培养基(G I BCO)、胎牛血清(FB S, H yclone)、青霉素、链霉素(华北制药厂)、F ico ll 400(Pharm acia)、H ank’s液,40目不锈钢网, H EPES(Sigm a)、D T Z(Sigm a)、(OA,北京华美)。胰岛素放免药盒(北京原子高科技核技术应用股份有限公司灵敏度:1.5m I U L;精密度:批内Cvv5%,批间Cvb10%) 2 实验方法 2.1胰岛细胞的分离纯化:胰腺的原位灌注:W istar大鼠禁食16h后,10%水合氯醛腹腔麻醉,常规消毒后经腹中线开腹。暴露胆管,寻找胆管穿过胰腺进入十二指肠处,320丝线穿过(暂不结扎),充分暴露胰尾,在肝门胆管分叉处逆行胆管插管,少量推入含冷却的胶原酶(1m g m l)
血管内皮祖细胞与血管新生的研究进展(一)
血管内皮祖细胞与血管新生的研究进展(一) 【关键词】血管内皮祖细胞；血管新生 血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一类能分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。大量的研究显示，动员和移植的EPCs可提高缺血组织的血管新生能力，促进损伤血管的修复和再内皮化，这为治疗以坏死性血管炎为主要病理改变的一类疾病带来了新的希望。因此EPCs已成为目前的研究热点之一，本文就血管内皮祖细胞与血管新生的关系及其在治疗性血管新生中应用的研究进展作一综述。 1内皮祖细胞的来源 内皮祖细胞（EPCs）是近年来研究较多的一类细胞。1997年Asahara等〔1〕首次从成人外周血单个核细胞中分离得至CD34+细胞，因其在体外可向内皮表型细胞分化，表达内皮细胞标志物并且参与血管形成，故将此命名为EPCs。EPCs也叫成血管细胞，是一种多能干细胞，能循环、增殖并分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，不能形成管腔样结构。EPCs起源于胚外中胚层卵黄囊血岛，由位于血岛外层的造血/成血管细胞（又称原血干细胞，是造血干细胞和内皮祖细胞的共同起源）分化发育而来。目前，许多研究证明，EPCs在成人外周血，人脐带静脉血和骨髓中均有分布，且人外周血、脐带血的EPCs均来自于骨髓。EPCS的来源还有多潜能成体祖细胞(multipotentadultprogenitorcells，MAPCs)、骨骼肌〔2〕。Lin等〔3〕发现骨髓来源的EPCs增殖能力明显高于成熟循环内皮细胞，两者体外扩增能力之比为50:1。在骨髓内EPCs与造血干细胞和骨髓基质细胞之间存在着密切联系，造血干细胞和骨髓基质细胞可影响EPCs的发育、增殖、动员和迁移。Murahara 等〔4〕用免疫磁珠分离法从脐血中成功地分离出EPCs，这些细胞经培养可以摄取as-LDL，释放NO，表达VE-cadherin、CD31和vWF。在体外扩增后回输到裸鼠肢体缺血模型，发现EPCs参与了缺血局部新生毛细血管的形成，因此脐血可成为EPCs研究的细胞来源。Gehling 等〔5〕从G-CSF动员的外周血中分离到CDl33+细胞，在VEGF和干细胞生长因子的诱导下形成了内皮细胞。 Zengin等〔6〕研究发现在成人几乎各个脏器的大中血管的平滑肌和外膜之间存在一个“血管发生区域”，该区域中也存在着CD34+、VEGFR-2+的EPC，并且有少部分细胞为CD45+。该区域可能是出生后血管发生的源泉，且与肿瘤的血管生成有关。 2EPCs的表面标记 由于EPCs与造血细胞(hematopoieticstemcells，HSCs)有着共同的起源，所以它们具有许多共同的表面标记，如CD34、CD133、VEGFR-2、Eph等；EPCs进一步分化为成熟内皮细胞，两者都表达内皮细胞特异性的表面标志，包括VEGFR-2、Tie-1、Tie-2和VE-cadherin〔7〕。这些相同的表面标记使EPCs的分选变得非常困难，其中有3个最重要的表面标志：CD34、CD133、VEGFR-2。一般将CD34+／CD133+／KDR(VEGFR-2+或Flk-l+)的细胞定义为EPCs。有研究表明，同时表达CD133、VEGFR-2和CD34的细胞具有迁移并分化为成熟内皮细胞的能力，能够促进出生后的血管形成。 CD34是一种白细胞分化抗原，它选择性地表达在造血前体细胞、血管内皮细胞、间质前体细胞和各种问质肿瘤细胞中，是骨髓、外周血和脐血中HSCs的主要标志，可同时识别出包括HSCs、EPCs和成熟内皮细胞的混合细胞群。从外周血中分离出的CD34细胞在体外能够向内皮细胞分化，在体内能够促进新生血管形成，因此，这些细胞可能大多数为EPCs。但是，近来研究发现，CD34-细胞群体中也含有EPCs〔8〕，这使得用CD34来富集EPCs的方法受到挑战。 CD133(又称AC133)是存在于人细胞表面的糖蛋白，相对分子质量为120000的糖基化多肽，含有5个跨膜结构域，包括膜外的N端及胞浆内C残端，选择性地在人类胎肝、骨髓和血
毛细血管(二)
毛细血管（二） 毛细血管（capillary）是管径最细，分布最广的血管。它们分支并互相吻合成网（图8－8）。各器官和组织内毛细血管网的疏密程度差别很大，代谢旺盛的组织和器官如骨骼肌、心肌、肺、肾和许多腺体，毛细血管网很密；代高血压较低的组织如骨、肌腱和韧带等，毛细血管网则较稀疏。 图8-8 人胃粘膜血管铸型扫描电镜像示毛细血管网 （一）毛细血管的结构 毛细血管管径一般为6～8μm，血窦较大，直径右达40μm。毛细血管管壁主要由一层内皮细胞和基膜组成。细的毛细血管横切面由一个内皮细胞围成，较粗的毛细血管由2～3个内皮细胞围成。内皮细胞基膜外有少许结缔组织。在内皮细胞与基膜之间散在有一种扁而有突起的细胞，细胞突起紧贴在内皮细胞基底面，称为周细胞（pericyte）（图8－9，8－10）。周细胞的功能尚不清楚，有人认为它们主要起机械性支持作用；也有人认为它们是未分化的细胞，在血管生长或再生时可分化为平滑肌纤维和成纤维细胞。 图8-9 毛细血管扫描电镜像示周细胞 P 周细胞胞体 1、2周细胞突起
图8-10 毛细血管电镜像 左图连续毛细血管，中图有孔毛细血管，右图毛细血管扫描电镜像示内皮孔 E 内皮细胞，P周细胞，↑内皮细胞孔 (二)毛细血管的分类 光镜下观察，各种组织和器官中的毛细血管结构相似，但在电镜下，根据内皮细胞等的结构特点，可以将毛细血管分为三型。 1．连续毛细血管连续毛细血管（continuous capillary）的特点为内皮细胞相互连续，细胞间有紧密连接等连接结构，基膜完整，细胞质中有许多吞饮小泡。连续毛细血管分布于结缔组织、肌组织、肺和中枢神经系统等处。肺和中枢神经系统内的毛细血管内皮细胞甚薄，含吞饮小泡较少（图8－10）。 2．有孔毛细血管有孔毛细血管（fenestrated capillary）的特点是，内皮细胞不含核的部分很薄，有许多贯穿细胞的孔，孔的直径一般为60～80nm（图8－10）。许多器官的毛细血管的孔有隔膜封闭，隔膜厚4～6nm，较一般的细胞膜薄。内皮细胞基底面有连续的基板。此型血管主要存在于胃肠粘膜、某些内分泌腺和肾血管球等处。肾血管球的内皮细胞的孔没有隔膜。 3．血窦血窦（sinusoid）或称窦状毛细血管（sinusoid capillary），管腔较大，形状不规则，主要分布于肝、脾、骨髓和一些内分泌腺中。血窦内皮细胞之间常有较大的间隙，故又称不连续毛细血管（discontinuous capillary）。不同器官内的血窦结构常有较大差别，某些内分泌腺的血窦，内皮细胞有孔，有连续的基板；有些器官如肝的血窦，内皮细胞有孔，细胞间隙较宽，基板不连续或不存在。脾血窦又不同于一般血窦，其内皮细胞呈杆状，细胞间的间隙也较大。 （三）毛细血管与物质交换 毛细管是血液与周围组织进行物质交换的主要部位。人体毛细血管的总面积很大，体重60kg的人，毛细血管的总面积可达6000m2。毛细血管管壁很薄，并与周围的细胞相距很近，这些特点是进行物质交换的有利条件。 物质透过毛细血管壁的能力称毛细血管通透性（capillary permeability）。毛细血管结构与通透性关系的研究表明，内皮细胞的孔能透过液体和大分子物质，吞饮小泡能输送液体，细胞间隙则因间隙宽度和细胞连接紧密程度的差别，其通透性有所不同。基板能透过较小的分子，但能阻挡一些大分子物质。另外一些物质，如O2、CO2和脂溶性物质等，可直接透过内皮细胞的胞膜和胞质。