小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定_李美玲

[文章编号]　1007-3949(2011)19-06-0465-05·实验研究·小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

李美玲,刘凤姣,刘　玲

(中南大学湘雅二医院心内科,湖南省长沙市410011)

[关键词]　内皮祖细胞;　骨髓;　小鼠

[摘　要]　目的　建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞的方法。方法　通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增,诱导分化为内皮祖细胞。应用流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:C D34、C D31、F l k-1和祖细胞标志C D133。结果　经密度梯度离心和差速贴壁法分离所得的细胞经E B M-2专用培养基培养后,第4天可见集落形成,培养第12天流式细胞仪检测其C D34、

C D133、F l k-1、C D31的阳性率分别为65%±4%、48%±3%、37%±3%和51%±4%。结论　从小鼠骨髓中分离培

养与定向诱导分化内皮祖细胞的方法效率高,稳定性和重复性好。

[中图分类号]　R34[文献标识码]　A

I s o l a t i o n,C u l t u r ea n dI d e n t i f i c a t i o no fMo u s eB o n eMa r r o w-d e r i v e dE n d o t h e l i a l

P r o g e n i t o r C e l l s

L I M e i-L i n g,L I UF e n g-J i a o,a n dL I UL i n g

(D e p a r t m e n t o f C a r d i o l o g y,t h e S e c o n d X i a n g y aH o s p i t a l o f C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t y,C h a n g s h a,H u n a n410011,C h i n a)

[K E Y WO R D S]　E n d o t h e l i a l P r o g e n i t o r C e l l s;　B o n e M a r r o w;　M o u s e

[A B S T R A C T] A i m　T o e s t a b l i s ha ne f f i c i e n t a n d s t a b l e m e t h o d f o r i s o l a t i o n,c u l t u r e a n d d i r e c t i o n a l d i f f e r e n t i a t i o n

o f e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s f r o mm o u s e b o n e m a r r o w. Me t h o d s　M o n o n u c l e a r c e l l s w e r e i s o l a t e d f r o mm o u s eb o n e m a r r o wb y d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o na n d d i f f e r e n t i a l a d h e s i o n m e t h o d.T h e r e m a i n i n g c e l l s w e r e c u l t u r e d a n d d i f f e r e n-t i a t e dt o e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s i n E B M-2.T h e e x p r e s s i o n s o f s p e c i f i c a n t i g e n s(C D34,C D133,F l k-1a n dC D31)o n

c e l l s u r f a c e w e r e a n a l y z e db y f l o wc y t o m e t e r. R e s u l t s　C e l l s w e r e o b t a i n e

d f r o mm o u s

e b o n e m a r r o wb y d e n s i t y g r a d i-

e n t c e n t r i

f u

g a t i o na n dd i f f e r e n t i a la d

h e s

i o nm e t h o df o r m e dc l u s t e r sa t d a y4.A td a y12,p o s i t i v er a t i o so fC D34+,

C D133+,F l k-1+a n dC D31+w e r e65%±4%,48%±3%,37%±3%a n d51%±4%,r e s p e c t i v e l y. C o n c l u s i o n

　A ne f f i c i e n t,s t a b l e a n dr e p l i c a b l e m e t h o df o r i s o l a t i o na n d c u l t u r e o f e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s f r o m m o u s e b o n e m a r-

r o wh a s b e e ne s t a b l i s h e d.

内皮祖细胞(e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s,E P C)是成熟血管内皮细胞的前体细胞,包括从成血管母细胞到成熟内皮细胞之间的多个阶段的细胞,有旺盛的增殖分化能力,可向血管新生部位(包括缺血组织及肿瘤微环境)趋化并分化成为成熟内皮细胞[1]。E P C主要存在于骨髓之中,在机体出现缺血、组织损伤或受到细胞因子、药物等刺激的情况下,可从骨髓向靶部位动员、归巢、分化,形成新生血管,参与血管再生及损伤血管的再内皮化。因此其在临床各种缺血性疾病、血管损伤及动脉粥样硬化方面有着广阔的应用前景[2-5]。研究发现,E P C不仅参与胚胎血管生成,还在胎儿出生后的血管新生和血管内皮损伤修复过程中起着重要作用[6]。E P C 可以由外周血、脐血、骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但获取单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异。为获得群体均一、纯度较高的E P C,本实验采用密度梯度离心法及差速贴壁法结合特殊培养基成功扩增培养出E P C,并进行鉴定,希望为实验研究和临床应用提供简便和安全可靠的方法。

[收稿日期]　2011-01-25

[基金项目]　国家自然科学基金资助项目(30973159)

[作者简介]　李美玲,硕士研究生,研究方向为餐后血脂紊乱与动脉粥样硬化,E-m a i l为m l l i2013@163.c o m。通讯作者刘玲,副教授,硕士研究生导师,研究方向为餐后血脂紊乱与动脉粥样硬化,E-m a i l为f e l i u l i n g@m e d m a i l.c o m.c n。